Clonación del gen vhb proveniente de Vitreoscilla stercoraria y evaluación de su efecto sobre la biosíntesiss de rifamicina B por Amycolatopsis mediterranei - Guerra Ramírez, Priscila (Universidad Autónoma Metropolitana, 2006)
La rifamicina es un antibiótico ansamicínico naftalénico producido por la bacteria Gram positiva Amycolatopsis mediterranei, que pertenece al orden de los Actinomycetales. Este antibiótico se usa contra los patógenos Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae (causantes de la tuberculosis y lepra, respectivamente), Mycobacterium avium (asociado con el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida, SIDA) y Pneumococcus, entre otros, y actúa inhibiendo específicamente la síntesis de ARN al unirse a la subunidad β de la ARN polimerasa. Debido a la amplia demanda de la rifamicina, por su gran valor práctico contra este tipo de enfermedades, se han desarrollado diversas estrategias para incrementar su producción, como la obtención de cepas mejoradas mediante mutagénesis clásica, la modificación en la composición del medio de cultivo (adición de Barbital, por ejemplo), la recombinación genética, y, recientemente, la utilización de métodos de clonación génica. Un problema recurrente en la producción de rifamicina a nivel industrial ha sido que las cepas de alta producción tienden a producir caldos extremadamente viscosos, lo que ocasiona una gran dificultad para proporcionar un adecuado mezclado y aporte de oxígeno en el biorreactor; esta viscosidad es consecuencia de la forma filamentosa y ramificada (miceliar) en que crece A. mediterranei. La menor transferencia de oxígeno en edades avanzadas del cultivo provoca el cese de la producción de rifamicina B. En este trabajo se plantea, como posible solución a este problema de demanda de oxígeno, la introducción de un gen bacteriano que codifica para la síntesis de una proteína (hemoglobina bacteriana) con capacidad de transporte de oxígeno. En la producción de otros antibióticos como la cefalosporina, se ha demostrado que la expresión intracelular del gen de la hemoglobina bacteriana (vhb, aislado de Vitreoscilla stercoraria) en Acremonium chrysogenum incrementa la captación de oxígeno, también considerado uno de los principales factores limitantes de la producción de este antibiótico. El gen de hemoglobina bacteriana ha sido expresado también en E. coli y en Saccharopolyspora erythraea, que al igual que Amycolatopsis mediterranei pertenece al grupo de los actinomicetos. La introducción del gen vhb con el promotor constitutivo PermE en A. mediterranei se realizó utilizando el plásmido pUAMSAG1 como vehículo de clonación. Este es un plásmido construído a partir del plásmido pULVK2, un plásmido bifuncional A. mediterranei-E. coli, y del plásmido pIJ4026, del que se tomó el marcador de resistencia a eritromicina. Se probaron diferentes metodologías para transformar A. mediterranei, como la transformación por electroporación, con protoplastos y utilizando cationes alcalinos y polietilenglicol, así como combinaciones de las mismas sin lograr obtener transformantes. Finalmente, resultó exitoso el método de transformación por biobalística. Dos de las diez transformantes seleccionadas por resistencia a eritromicina y mayor captación de oxígeno se evaluaron en condiciones de baja aireación. Para la cuantificación de rifamicina B se utilizó el método espectrofotométrico, observándose un incremento estadísticamente significativo en la producción de rifamicina B de la transformante BII10 de 13.9% en la fermentación con barbital y de 29.5% en la fermentación sin barbital. La utilización de técnicas moleculares dirigidas, en este caso la expresión heteróloga de un gen para una hemoglobina bacteriana, permitió aumentar la producción de rifamicina B por A. mediterranei en condiciones limitantes de oxígeno. La producción preliminar de rifamicina B obtenida en este experimento probablemente no refleja la producción potencial de esta nueva cepa; será necesario optimizar las condiciones de cultivo para esta cepa en particular.