Efecto del fenoxaprop-etil (FE) sobre la capacitación de espermatozoides de cerdo in vitro - Hernández López, Alejandro (Universidad Autónoma Metropolitana, 2007)
Debido a que existen limitaciones para establecer los efectos específicos de un herbicida sobre las diferentes funciones de un organismo, es necesario el uso de modelos de estudio tanto in vivo como in vitro. El Fenoxaprop-Etil (FE) es un herbicida de uso común y aunque no hay reportes sobre su riesgo toxicológico, en un trabajo previo, realizado en el Laboratorio de Biología Celular de la UAM-I, se estableció que tiene efectos sobre la viabilidad y la movilidad de espermatozoides. Esto plantea la posibilidad de que la capacitación espermática se encuentre afectada. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto del FE sobre la capacitación espermática in vitro. Los experimentos se realizaron en espermatozoides conservados por 24h en diluyente comercial. Primero se validó la técnica para evaluar la viabilidad por citometría de flujo (CF) con la adición de yoduro de propidio (IP), y se comparó con la técnica tradicional por microscopia óptica con eosina nigrosina (EN), no mostrando diferencia significativa entre ambas técnicas, por lo que en los estudios subsecuentes sólo se utilizó la técnica citométrica. En segundo lugar se probó el efecto de la exposición de los espermatozoides durante una hora al solvente del FE (etanol al 5%) en medio TALP-HEPES, concentración máxima usada en estudios previos. Dado que en las condiciones de este experimento el etanol sí afectó la viabilidad, se realizó otro donde se probaron concentraciones menores (0.5, 1, 2 y 3%) y con estas, ni la viabilidad ni la capacitación se vieron afectadas, por lo que sólo se usaron éstas concentraciones de etanol para diluir al FE. Con esta información se procedió a determinar el efecto del FE sobre la viabilidad, para lo cual se tomaron dos alícuotas de cada una de las muestras. La primera se sometió a tratamiento por una hora con etanol a 0, 0.5, 1, 2 y 3% como control de solvente del FE. La segunda se sometió a tratamiento una hora con 0, 50, 100, 200 y 300 µM de FE en medio TALP-HEPES. Después del tratamiento por una hora con etanol o con FE, los espermatozoides se lavaron e incubaron en medio TALP-HEPES suplementado con piruvato de sodio y albúmina sérica bovina (condiciones capacitantes). Se tomaron alícuotas a las 0, 1 y 3 horas posteriores al tratamiento (hpt). Se cuantificaron los porcentajes de viabilidad con IP y la capacitación con merocianina 540 (M540) por citometría de flujo. Los resultados indican que 0 hpt a las concentraciones 200 y 300µM de FE, disminuyen significativamente la viabilidad de los espermatozoides con respecto al control. A 1 hpt todas las concentraciones la afectan significativamente. Mientras que a 3 hpt, solo la concentración 300 µM la continúa afectando. Se evaluó la capacitación y se encontró que la exposición de los espermatozoides a FE en concentraciones de 50, 100, 200, y 300 µM favorece el intercalamiento de la M540 en la membrana del espermatozoide con respecto al control de manera significativa a 0 hpt y 1 hpt, mientras que a las 3 hpt solo lo continúa haciendo en la concentración de 300 µM. Los resultados demuestran que el FE reduce la viabilidad de los espermatozoides e incrementa el intercalamiento de la M540, aunque no se puede afirmar que se estén capacitando. Una posible explicación es que el FE puede estar afectando la membrana externa del espermatozoide promoviendo la salida del colesterol y lipoperoxidando a los fosfolípidos como lo hace en plantas; ambos eventos favorecen el intercalamiento de la M540. No se descarta que el FE interrumpa una vía de señalización e impida al espermatozoide llevar la secuencia normal de los eventos relacionados con la capacitación.; Due to limitations to study the specific effects of herbicide over different functions in organisms; it is necessary the use models, in vivo as well as in vitro. Fenopaprop-Etil (FE) is a common herbicide, although there are not reports about its toxic risk, in a previous study made in the Laboratory of Cell Biology at UAM-I, it was established its effect on sperm viability and motility. This raises the possibility that the sperm capacitation would be affected. The aim of this study was to determinate the effect of FE on the sperm capacitation in vitro. The experiments were made using fresh spermatozoa stored 24 hours in commercial diluent. First, step was to establish and validate the technique to evaluate the viability by flow citometry (CF) adding propidium iodide (IP) in comparison with the traditional microscopic technique with the addition of eosin-nigrosin (EN). There was not significant difference between both techniques. Then in the following studies, cytometric technique was used. After that, the effect of the sperm exposition to the solvent in the highest concentration (ethanol 5%) dissolved in TALP-HEPES medium, used in previous studies, was tested for 1 hour. Due that ethanol affected viability, it was made other assay testing lower concentrations (0.5, 1, 2 y 3%). In this case, neither viability nor the capacitation were affected, therefore, these ethanol concentrations were used to dissolve the FE. Whit this information was determined the FE effect on the viability and capacitation. Two aliquots from each sample were used. One was treated 1 hour with 0, 0.5, 1, 2 and 3% of ethanol as a control. Second aliquot was treated by 1 hour with 0, 50, 100, 200 and 300 µM FE in TALP-HEPES medium. After 1 hour of treatment spermatozoa were washed and incubated in TALP-HEPES medium supplemented with sodium piruvate and BSA for 0, 1 and 3 additional hours (hpt). It was quantified the viability with IP and capacitation with merocyanine 540 (M540) by flow cytometry. The results show that, 200 and 300 µM FE concentration, reduce significantly the sperm viability, respect to the control at 0 hpt. After one hpt it was significantly affected at all concentrations. Meanwhile 3 hpt the viability was only affected by the 300µM concentration. It was found that 0 hpt and 1 hpt, 50, 100, 200 add 300 µM FE concentrations facilitate the M540 intake in the sperm membrane, while 3 hpt it was only increased at 300 µM concentration. The results demonstrate that the FE reduced the spermatozoa viability and increased the M540 intake, although it does not necessarily represents spermatozoa capacitation. A probable explanation is that the FE can be affecting the external membrane, promoting the cholesterol releasing and oxidizing to the lipids on the membrane, as it does in plants. Both actions promote the M540 intake. Other possibility is that EF cut off a signalization pathway impairing the spermatozoa to follow the events related with the sperm capacitation.