Extracción de astaxantina a partir de residuos de camarón ensilados por métodos ácido y bacteriano - Franco Zavaleta, Miriam Elizabeth (Universidad Autónoma Metropolitana, 2010)
El crecimiento de la industria camaronera ha generado gran cantidad de desechos, principalmente la cabeza y caparazón, que no son aprovechados y representan un grave problema de contaminación. El pigmento carotenoide más abundante en los desechos de camarón es la astaxantina (3,3'dihidroxi-ß-caroteno 4,4-diona), utilizada en la dieta de salmónidos para lograr el tinte rojo-rosado que distingue a estas especies. El ensilado ácido es un proceso previo a la extracción del pigmento, aumentando la conservación del material debido a la acción de ácidos que son adicionados en forma química o producidos por vía microbiana, promoviendo la disminución del pH a niveles suficientemente bajos para evitar el crecimiento de microorganismos no deseables. El objetivo de esta tesis fue determinar la eficiencia en la extracción de astaxantina a partir de desechos de camarón sujetos a ensilados ácido y bacteriano, así como la cuantificación del pigmento en dichos ensilados. Se estudió también el efecto de los factores ambientales (luz, temperatura y disponibilidad de oxígeno) en la estabilidad de la astaxantina en dos sistemas modelo y en una pasta cárnica simple. Este trabajo se enmarca en el contexto de los procesos de separación en Biotecnología. La presente tesis fue dividida en tres secciones: en la etapa I se determinaron las condiciones óptimas del ensilado químico y bacteriano en desechos de camarón del Golfo de México (Litopenaeus aztecus, camarón café). Para el ensilado químico se probaron tres ácidos (fórmico, acético, propiónico) y sus combinaciones en diferentes concentraciones; se seleccionaron las mezclas más eficientes en la reducción del pH y rendimiento de astaxantina. Estas mezclas fueron ácidos 4%fórmico:4%acético y 4%fórmico:4%propiónico (v/p), las cuales se aplicaron en los desechos logrando disminución de pH de 8.5 a 4.28 (FA) y 4.40 (FP). En el ensilado bacteriano los desechos fueron adicionados con un inóculo de Pediococcus pentosaceus (5% v/p) y dextrosa (10%), observándose una disminución de pH de 8.32 a 4.84. Para seleccionar el método de extracción más eficiente, ambos ensilados acidificados fueron sometidos simultáneamente a dos procesos secuenciados: 1) extracción previa del pigmento con una mezcla de disolventes (éter de petróleo:acetona:agua, 15:75:10), seguida por centrifugación (secuencia EC); 2) centrifugación del sustrato y posterior extracción con el sistema de solventes (secuencia CE). En ambos casos se obtuvo un residuo sólido y un licor. Tanto en los ensilados como en sus fracciones se analizó el contenido de cenizas, proteína total y lípidos. La concentración del pigmento fue analizada espectrofotométricamente y determinada como xantofilas totales; asimismo, la astaxantina fue analizada y cuantificada por cromatografía de líquidos. Durante el proceso de ensilado químico las sales de calcio fueron parcialmente disueltas debido a la acción de los ácidos, disminuyendo el contenido de cenizas con respecto a los residuos frescos (5.5% en EC y 12.7% en CE, en ensilado con ácidos fórmico-acético; 12.6% en EC y 14.6% en CE en el ensilado con ácidos fórmico-propiónico), encontrando diferencias significativas (P<0.001) entre las fracciones pero no entre las formulaciones. La concentración de proteínas disminuyó no significativamente (P>0.01), ni entre las fracciones ni entre las formulaciones (2.2 y 3.07% con ácidos fórmico-acético y fórmico-propiónico, respectivamente). La concentración de lípidos disminuyó significativamente en los ensilados con respecto al residuo fresco (72 y 19 % en EC y CE con ácido fórmico:acético, y 65.5 y 40% en EC y CE con ácidos fórmico:propiónico) (P<0.001). En el ensilado bacteriano el contenido de cenizas disminuyó, con respecto a los residuos frescos, en ambas secuencias de proceso sin diferencias significativas entre ambos (30%) (P>0.01), al igual que la concentración de proteínas (7%); se encontraron diferencias significativas entre las fracciones con respecto al contenido de cenizas (P<0.001) pero no en la concentración de proteínas (P>0.01). El contenido de lípidos disminuyó significativamente en la secuencia EC (69.1% con 1.88 g/100 g) que en la secuencia CE (1.15% con 6.03 g/100 g) con respecto a los residuos frescos (P<0.001). La mayor concentración de xantofilas totales se obtuvo en el licor del ensilado químico en la secuencia centrifugación-extracción, donde se incrementó la concentración en 30.6 y 23.7% en los residuos tratados con mezclas de ácidos fórmico:acético y fórmico:propiónico, respectivamente, con respecto al residuo fresco, sin encontrar diferencias significativas entre las formulaciones (P>0.01). De igual forma, la mayor concentración de astaxantina se encontró en el licor del ensilado químico, en la misma secuencia CE (7.72 E-03 mg/mL de licor), mientras que en el ensilado bacteriano empleando la misma secuencia CE la concentración de astaxantina en el licor fue de 5.58 E-03 mg/mL. Se concluyó que durante el ensilado ácido la astaxantina no sufrió oxidación. Asimismo, se observó un incremento en la concentración, tanto de xantofilas totales como de astaxantina, debido a que en el ensilado previo a la extracción se hidrolizó el complejo carotenoproteina, liberando los pigmentos carotenoides. En la etapa II del estudio, y con el fin de comparar el proceso en otra especie de camarón, se realizaron los ensilados químico y bacteriano previos a la extracción del pigmento aplicando el método más eficiente obtenido en la etapa anterior y utilizando desechos de camarón del Pacifico (Litopenaeus vannamei, camarón blanco). Los desechos molidos fueron adicionados con la mezcla de ácidos 4%fórmico:4%acético (v/p desechos) observándose reducción del pH de 7.98 a 3.5, comprobándose que fue posible realizar el ensilado mediante el uso de ácidos orgánicos. En el ensilado bacteriano se utilizó el inóculo de Pediococcus pentosaceus ensayado anteriormente, reduciendo el pH de 7.98 a 4.17. Los ensilados fueron almacenados bajo las mismas condiciones y sujetos a las dos secuencias de extracción ya descritas en la etapa anterior: extracción-centrifugación y centrifugación-extracción. En los residuos de L. vannamei, se confirmó que durante el ensilado químico hubo una reducción significativa en el contenido de cenizas (23.1 y 15.3% respectivamente para EC y CE) respecto al residuo fresco (P<0.001). La concentración de proteínas tuvo un decremento menor al observado con L. aztecus (1.6 y 4.2% para EC y CE, respectivamente), con respecto a los residuos frescos, no encontrando diferencia significativa entre las fracciones (P>0.01). También se observó una disminución significativa en el contenido de cenizas en ensilado bacteriano (27.7 y 19.5% para EC y CE, respectivamente) con respecto a los residuos frescos (P<0.001). La concentración de proteína disminuyó en 6.3 y 3.3 % para EC y CE respectivamente, con relación al residuo fresco, sin presentar diferencias significativas entre las fracciones (P>0.01), observando menor pérdida en estos componentes durante el ensilado químico en comparación al bacteriano. Los resultados obtenidos en la cuantificación del pigmento en desechos de L. vannamei siguieron un comportamiento similar a los residuos de L. aztecus. En el ensilado químico de residuos de L. vannamei, siguiendo la secuencia de procesos CE, se alcanzó la mayor eficiencia en la extracción del pigmento, con incremento en el rendimiento de xantofilas totales de 49.8% con respecto al residuo fresco; en esta misma secuencia de exse extracción se tuvieron las máximas concentraciones de astaxantina, tanto en el ensilado químico (7.72 E-03 mg/mL licor), como en el bacteriano (5.383 E-03 mg/mL licor), con incremento en la concentración del pigmento del 99 y 40% respectivamente, con relación al contenido inicial en los residuos frescos. Se concluyó que durante el ensilado ocurre una hidrólisis parcial del complejo caroteno-proteína liberando los pigmentos carotenoides e incrementando su rendimiento. En la etapa III se estudió el efecto causado por factores ambientales (luz, oxígeno, temperatura) en la estabilidad de la astaxantina, empleando dos sistemas modelo, proteico y lipídico, y en una pasta cárnica simple. Los desechos de camarón (L. vannamei) fueron ensilados con ácidos 4%fórmico:4%acético y almacenados a 4°C por 24 h; el pigmento fue extraído con la mezcla de éter de petróleo:acetona:agua (15:75:10), bajo la secuencia CE. Los solventes fueron evaporados del licor obteniendo un sólido y fue disuelto en acetona dando una concentración de 1.703 E-02 mg astaxantina/mL acetona. Se adicionaron alícuotas del extracto en los sistemas modelos: proteico (albúmina de huevo al 1%) y lipídico (aceite de girasol). Las fuentes de variación fueron: aire (ausencia, presencia), iluminación (luz, obscuridad), temperatura (4 y 20°) y tiempo de almacenamiento (1 a 5 semanas). La estabilidad del pigmento en ambos sistemas fue analizada como xantofilas totales y astaxantina. En el sistema proteico las muestras almacenadas en aire/obscuridad/20ºC presentaron la mayor degradación de xantofilas, observando un rápido descenso durante la primera semana de almacenamiento, mostrando una menor degradación en las semanas subsecuentes. El contenido de xantofilas totales fue significativamente afectado por la iluminación, temperatura, disponibilidad de aire y el tiempo de almacenamiento (P<0.001). Sin embargo, estos factores no tuvieron un efecto significativo en la concentración de astaxantina (P>0.01). Las muestras almacenadas en aire/obscuridad/20oC mostraron altos niveles de oxidación de astaxantina, mientras que las almacenadas sin-aire/luz/4°C presentaron menores niveles de oxidación. En el sistema lipídico, el contenido de xantofilas totales disminuyó en menor proporción (decremento de 4 a 8% respecto al valor inicial) comparado con el sistema proteico (decremento de 65 a 90% respecto al valor inicial). Las muestras almacenadas en condiciones de aire/luz/20oC, aire/oscuridad/4oC y aire/oscuridad/20oC, presentaron altos niveles de degradación (decremento de 7.4, 7.9 y 7.4% respectivamente, con relación al contenido inicial); mientras que las muestras almacenadas sin- aire/luz/4oC y sin-aire/obscuridad/4oC presentaron menor degradación (decremento de 4.8 y 4.1%, respectivamente). Las xantofilas totales fueron significativamente afectadas por la disponibilidad de aire, temperatura y tiempo de almacenamiento (P<0.001), siendo éste último, el factor que causó mayor efecto. Sin embargo, la disponibilidad de aire, iluminación y la temperatura no tuvieron efecto significativo sobre la astaxantina (P>0.01), que solo fue afectada significativamente por el tiempo de almacenamiento (P<0.001). El aceite de girasol actúo como barrera al oxígeno, dando mayor protección a la astaxantina en comparación con el sistema proteico. Asimismo, el contacto entre las moléculas de astaxantina y los antioxidantes naturales y sintéticos añadidos al aceite durante su procesamiento podrían tener un papel importante para retardar la degradación de astaxantina. Se concluyó que en la estabilidad, tanto de xantofilas totales como de astaxantina, las fuentes de variación más importantes fueron la disponibilidad de oxígeno y el tiempo, mientras que la temperatura y la luz no mostraron efectos significativos sobre los pigmentos almacenados durante cinco semanas de estudio. Las xantofilas totales y la astaxantina fueron mas estables en un sistema lipídico que en un proteico. En la pasta cárnica, las concentraciones de xantofilas totales y astaxantina disminuyeron con una degradación severa después de la segunda semana de almacenamiento en todos los tratamientos. Se encontraron diferencias significativas entre las concentraciones iniciales añadidas, tanto en xantofilas totales como en astaxantina (P<0.001), así como con respecto al tiempo (P<0.001). Se concluyó que la escasa estabilidad de las xantofilas totales y astaxantina en la pasta cárnica se debió a que éste es un sistema complejo formado por diversos componentes, los cuales no le proporcionaron suficiente protección al pigmento; algunos de estos componentes pudieron ejercer un efecto prooxidante, modificando la estructura y, consecuentemente, la estabilidad del pigmento.; The considerable grow in shrimp production generates large amounts of wastes, mainly heads and exoskeleton. This material, when not utilized in an efficient way, is a pollution source. The most abundant carotenoid pigment in shrimp wastes is astaxanthin (3,3'-dihydroxy-ß-carotene 4,4-dione), forming part, in many cases, of salmonid diets to obtain the desirable red-orange color distinctive of this fish. Acid ensilation is a process applied prior to pigment extraction that improves shimp wastes preservation due to acid addition from chemial or microbial sources, reducing the substrate pH to values low enough as to prevent the growth of underisable microorganisms. The objective of this thesis was to study astaxanthin extraction from shrimp wastes previously subjected by chemical or microbial ensilation, and to study the extraction efficiency by quantifying the extracted pigment. The effect of environmental factors (light, temperature and oxygen availability) was also studied on astaxanthin stability in two model system and a meat emulsion. The work was divided into three sections. In section I, the best conditions for chemical and bacterial ensilation were studied in shrimp wastes obtained from the Gulf of Mexico (Litopenaeus aztecus, brown shrimp). Three organic acid were tested (formic, acetic and propionic) and combinations at different concentrations; the selected acid mixtures were those giving the lowest pH and the highest astaxanthin extraction yield. These mixtures were: formic (4%)-acetic (4%) acids, and formic (4%)-propionic (4%) acids (v/w), pH was lowered 8.5 to 4.25 and 4.40, respectively. Bacterial ensilation was carried out by adding 5% dextrose to the wastes (v/w) and inoculating a Pediococcus pentosaceus strain; substrate pH decreased from 8.32 to 4.84. In order to select the most efficient pigment extraction method, after chemical or bacterial ensilation the substrates were subjected to one of the following process sequences: 1) pigment extraction from the ensiled wastes using a solvent system (petroleum ether:acetone:water, 15:75:10), followed by centrifugation (EC process sequence); 2) centrifugation of the ensiled waste, followed by pigment solvent extraction using the solvent system described before (CE process sequence). In both cases, a solid residue and a liqueur were obtained. Ash, total protein and lipid content were analyzed in each obtained fraction. Pigment concentration was analyzed by spectrophotometry as total xanthophylls and by HPLC and reported as astaxanthin. Calcium salts were dissolved during chemical ensilation due to action of acids, decreasing ash content as compared to the raw material (5.5% in EC, 12.7% in CE in formic-acetic acid mixture; 12.6% in EC, 14.6% in CE in formic-propionic acid mixture), significant differences were found among fractions (P<0.001) but not among acid formulations (P>0.01). There was not significant differences (P>0.01) for formulations or fractions (2.2, 3.07% formic-acetic and formic-propionic, respectively). Lipid concentration significantly decreased with respect to the non-ensiled wastes (72 and 19%, EC and CE with formic-acetic acids, and 65.5 and 40%, EC and CE with formic- propionic acids) (P<0.001), mainly due to oxidation reactions. Ash content had similar decrease in the ensiled wastes subject to lactic fermentation in both process sequences bacterial silage (30%) (P>0.01); as well as for protein concentration (7%). Conversely, significant differences were found among fractions with respect to ash content (P<0.001) but not to protein concentration (P>0.01). Lipid content had a significantly higher decrease (P<0.001) in EC (69.1%, 1.88 g/100 g) than in CE (1.15%, 6.03 g/100 g) with respect non ensiled residues. The highest total xanthophylls concentration was observed in the liqueur obtained by chemical ensilation, in the CE process sequence, were it increased from 30.6 and 23.7% in wastes treated with formic-acetic and formic-propionic acids, respectively, with respect the non-ensiled wastes, but with no significant differences among acid mixtures (P>0.01). In a similar way, the highest Astaxanthin concentration was obtained in chemically ensiled wastes, after the CE process sequence CE (7.723E-03 mg astaxanthin/mL liqueur), whereas in wastes subjected to bacterial ensilation, the same CE sequence produce 5.583E-03 mg astaxanthin/mL liqueur. It was concluded that astaxanthin did not undergo any oxidative change during acid ensilation due to the reducing environment promoted by organic acids. In order to compare the results when wastes from other shrimp species was used, section II studied chemical and bacterial ensilation giving the highest astaxanthin yiel, in wastes from the Pacific coast (Litopenaeus vannamei, white shrimp). The ground wastes were mixed with formic (4%)-acetic (4%) acid mixture (v/w); pH decreased from 7.98 to 3.5 was observed. The bacterial ensilation was also carried out inoculating with a Pediococcus pentosaceus strain, pH decrease was from 7.98 to 4.17. Ensiled wastes were subjected to the same process sequences described above:: extraction-centrifuation (EC) and centrifugation-extraction (CE). As observed before, ash content was significantly reduced (23.1 and 15.3%, EC and CE, respectively) (P<0.001). Protein concentration reduction was less marked as in L. aztecus wastes, with no significant differences (P>0.01) with respect to non-ensiled wastes (1.6 and 4.2%, EC and CE, respectively). Similar as with L. aztecus, ash content in the bacterial silage significantly (P<0.001) decreased due to calcium salts solubilization at low pH (27.7 and 19.5%, EC and CE, respectively). Protein concentration non-significantly decreased in 6.3 and 3.3%, EC and CE respectively. Pigment content was similar to the one obtained in L. aztecus wastes. The highest yield was obtained with chemical ensilation of L. vannamei, following the CE process sequence. Total xanthophylls concentration increased 49.8% with respect to non-ensiled wastes. CE process sequence also gave the highest astaxanthin yields both for chemical (7.723 E-03 mg astaxanthin/mL liqueur), and bacterial ensilation (5.383 E-03 mg astaxanthin/mL liqueur), this is an increase of 99 and 40%, respectively with respect to the initial astaxanthin content in non- ensiled wastes. The increase in total xanthophylls and astaxanthin was also due to the carotene-protein complex hydrolysis, releasing the carotenoids and allowing a more efficient extraction. In section III the effect of environmental factors (light, oxygen and temperature) on astaxanthin stability was studied. Three model systems were used: a protein solution, a lipid and a meat emulsion. Shrimp wastes (L. vannamei) were mixed with a formic (4%)- acetic (4%) acid mixture, and stored at 4°C for 24 h; the pigment was extracted with a solvent system (petroleum ether:acetone:water, 15:75:10) by the CE process sequence already described. The solvents were completely evaporated and the solid redissolved in acetone to a final concentration 1.7032 E-02 mg astaxanthin/mL acetone. Aliquots of this pigment extract were added to the model ssytems: protein (1% egg albumin) and lipid (sunfower commercial oil). The sources of variation were: oxygen availability (air and air-free packages), illumination (darkness and under light), temperature (4 and 20°) and storage time (1 to 5 weeks). Pigment stability in both systems was analyzed as total xantophyll and astaxanthin concentration. Sample stored in air/darkness/20oC in the protein system were severely degraded as observed by a rapid decrease of xanthophylls and astaxanthin content during the first week of storage, and a moderate degradation during the rest of the storage time. Total xanthophylls content was significantly affected by illumination, temperature, oxygen availability and storage time (P<0.001). Conversely, these factors did not significantly affect astaxanthin concentration (P>0.01). Samples stored in air-free/light/ /4°C showed the lowest oxidation level. Total xanthophylls content in the oil decreased in a lesser extent than in the protein system (4 to 8% in the oil; 65 to 90% in the protein system). Samples stored in air/Light/ /20oC, air/darkness /4oC and air/darkness/20oC showed severe pigment degradation (7.4, 7.9 and 7.4% total xanthophylls decrease, respectively); whereas the samples stored in air-free/light/4oC and air- free/darkness/4oC had less degradation (4.8 and 4.1%, respectively). Total xanthophylls were significantly affected by oxygen availability, temperature and storage time (P<0.001), the last was the factor with the highest effect on pigment degradation. However, oxygen availability, illumination and temperature did not significantly affected astaxanthin degradation (P>0.01), only affected by storage time (P<0.001). Sunflower oil acts as oxygen barrier protecting astaxanthin, which did not occur in the protein system. Natural and synthetic antioxidants added to the commercial oil could also have an effect on astaxanthin prevention to degrade. It was concluded that total xanthophylls and Astaxanthin stability was mainly affected by oxygen and time, whereas temperature and light did not have significant effects on these pigment during a 5-week storage time. Total xantophyll and astaxanthin underwent severe degradation when added to a meat emulsion after two weeks of storage. Significant differences among initial xanthophylls and astaxanthin concentrations and throughout the storage time were found (P<0.001). It was concluded that this degradation was due to the complex system formed by the emulsion system itself and numerous different molecules, some of they may act as prooxidans.