Estudio del sistema ABTS/lacasa para su aplicación en la evaluación de la capacidad antioxidante de alimentos Público Deposited

Antioxidants are defined as chemical compounds able to delay or prevent oxidation reactions in carbohydrates, proteins, lipids and nucleic acids. The main mechanism involved in antioxidation is free radicals inactivation, that otherwise can start the deterioration of several cell metabolic processes. Free radicals and oxidants are oxygen-reactive compounds, being the cause of some chronic-degenerative diseases in human beings, such as cancer and cardiovascular conditions, among others. Inclusion of antioxidants in the diet may reduce the risk of such diseases onset. The antioxidant potential of a given food, making it able to neutralize or reduce free radicals, can be analyzed through its total antioxidant potential; this is a combination of the antioxidant activity of various compounds present in the food. A wide variety of in vitro methods have been developed during the last years for accurately analyze the antioxidant capacity of a number of substances. However, most of these methods require expensive reagents, sophisticated equipment as well as being time-consuming. The objective of this thesis was to develop a fast, simple and reproducible method to analyze the antioxidant capacity of food samples. A model ABTS/lacasse system was developed; it consisted on a chromogen [2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid), ABTS] and lacasse, an ABTS●+ free radical-generating polyphenoloxidase when in the presence of molecular oxygen. In order to generate free radicals, two lacasse sources were studied: DeniLite IISTM, a commercial product; and a lacasse extracted from the Japanese tree Rhus vernicifera. Both enzyme sources were spectrophotometrically characterized in order to assure that no interference occurred and to find the optimum detection waveleghth for ABTS●+ radicals (λ=728nm). pH and enzyme concentration for ABTS●+ lag time formation were studied, using standards such as gallic, ferulic and L-(+)-ascorbic acids. Both ABTS/laccase sources, DeniLite IISTM and Rhus vernicifera, showed that the ABTS●+ free radical formation time correlated to the antioxidant concentration, and followed a first order equation (y = mx+b) within a response range satisfying the Lambert-Beer Law. It was observed that, for DeniLite IISTM ABTS/lacasse, the conditions for inhibiting the ABTS●+ radical formation lag time occurred were: 0.063 ± 0.006 U laccase/mL, 0.5 mM ABTS, 0.1 M acetate buffer, pH 4. ABTS●+ lag time inhibition for the Rhus vernicifera ABTS/laccase conditions were: 0.17 ± 0.012 U lacasse/mL, 0.5 mM ABTS, 0.1 M acetate buffer, pH 4.0. The method developed and the analytical conditions were applied to analyze the antioxidant capacity of three materials: corn cobs, amaranth straw and freshly squeezed orange juice. This method was also compared to the one using ABTS/H2O2/raddish peroxide (HRP). It was observed that similar results were obtained using the systems developed in this thesis, and the ABTS/H2O2/HRP method. With all three methods, decreasing antioxidant capacity of water soluble extracts obtained from the tested materials was: orange juice>corn cob>amaranth straw. It was concluded that, the method developed in this thesis, using ABTS/lacasse, is simple and reproducible, and is accurately enough to analyze total antioxidant capacity of foods. It is also sensitive to differentiate the antioxidant ability of various sources, with similar sensitivity to the ABTS/H2O2/HRP method.

Los antioxidantes retrasan o impiden el proceso de oxidación de los carbohidratos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos al combatir a los radicales libres que se producen por los diversos procesos metabólicos en la célula. Estos compuestos son conocidos como especies reactivas del oxígeno y son la causa de algunas de las enfermedades que padece el humano como el cáncer, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurodegenerativas (Alzheimer y Parkinson), entre otras. Por lo que, el consumo de antioxidantes a través de la dieta puede reducir el riesgo de padecer este tipo de enfermedades. El potencial antioxidante que un alimento presenta para neutralizar o reducir radicales libres se puede determinar al estimar la capacidad antioxidante total, es decir, la actividad antioxidante combinada de los compuestos antioxidantes presentes en un alimento. En los últimos años se han desarrollado un gran número de métodos analíticos in vitro para determinar la capacidad antioxidante de diversas sustancias, sin embargo, muchos de estos métodos requieren de reactivos costosos, equipos sofisticados o tiempos prolongados para realizar las determinaciones. En este trabajo se desarrolló un método rápido, sencillo y reproducible para evaluar la capacidad antioxidante de muestras de alimentos. Para ello, se propuso el uso de un sistema modelo “ABTS/lacasa”, que incluye el compuesto cromógeno 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico) (ABTS) y lacasa, que es una polifenoloxidasa que genera radicales libres ABTS●+ en presencia de oxígeno molecular. Para el desarrollo del método se evaluaron dos fuentes de lacasa para la generación de radicales ABTS●+ : utilizando directamente el producto comercial DeniLite IIS y la lacasa extraída del árbol japonés Rhus vernicifera. Ambas fuentes enzimáticas se caracterizaron espectrofotométricamente, para descartar interferencias y para determinar la longitud de onda de detección de los radicales ABTS●+ que se estableció a λ = 728 nm. Por otro lado, se evaluó el efecto del pH y la concentración de enzima en la generación de tiempos lag de formación de radicales ABTS●+ . Para realizar lo anterior, se utilizaron antioxidantes estándares como los ácidos: gálico, ferúlico y L-(+)-ascórbico. Se encontró que los sistemas ABTS/lacasa de DeniLite IIS o de Rhus vernicifera permiten observar tiempos lag de formación de radicales libres ABTS●+ que se correlacionan con la concentración del antioxidante, ajustándose al modelo y = mx+b. Las condiciones donde se obtuvieron los tiempos lag de formación del radical ABTS●+ para el sistema ABTS/lacasa de DeniLite IIS utilizando 3 diferentes antioxidantes a distintas concentraciones fueron: 63.4 ± 5.8 U/mL y ABTS 0.5 mM en amortiguador de acetatos 0.1 M pH 4 a 25 °C. Por su parte, las condiciones donde se obtuvieron los tiempos lag de formación del radical ABTS●+ para el sistema ABTS/lacasa de Rhus vernicifera utilizando 3 diferentes antioxidantes a distintas concentraciones fueron: 172.6 ± 11.9 U/mL de lacasa y ABTS 0.5 mM en amortiguador acetatos 0.1 M pH 4 a 25 °C. Finalmente, los métodos desarrollados se aplicaron para evaluar la capacidad antioxidante de las muestras: olote de maíz, rastrojo de amaranto y jugo de naranja fresco. Los sistemas evaluados en este trabajo se compararon con el sistema ABTS/H2O2/peroxidasa de rábano (HRP) y se observó que los sistemas propuestos permitieron obtener el mismo orden decreciente de la capacidad antioxidante total de los extractos hidrosolubles de los alimentos de prueba, es decir, jugo de naranja > olote de maíz > rastrojo de amaranto. En conclusión el método que utiliza el sistema ABTS/lacasa es un método sencillo que se puede aplicar para la evaluación de la capacidad antioxidante total de alimentos, debido a que es sensible para diferenciar el poder antioxidante de diferentes fuentes, de la misma manera como sucede en el sistema ABTS/H2O2/HRP que se utiliza actualmente.

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