Estudio de las fracciones proteínicas del fluido folicular porcino en la maduración, fertilización in vitro y polispermia de ovocitos de cerdo Público Deposited
In vitro maturation and fertilization (IVM, IVF) programs in pigs have some problems, these are low rates of cytoplasmic maturation and high percentages of polyspermy. To the present time, it is not clear if these difficulties are related to culture conditions during maturation. It has been shown that porcine follicular fluid (pFF) increases the oocyte nuclear and cytoplasmic maturation, evaluated by the development of the male pronucleus (mPN) after IVF. However, there is controversy about its effects, depending on the follicular size from where the pFF is obtained. The objective of this study was to evaluate the effect of complete and fractionated pFF, on IVM, IVF and polyspermy, when added to the maturation medium. Porcine oocytes were collected from prepuberal gilts. The pFF was obtained by puncture of follicles smaller than 5 mm (pFF1) and from 5.1 to 8 mm in diameter (pFF2), the pFF from both categories showed a protein concentration of 60 ± 5 mg/ml. The negative control was normalized as 100%. Both pFF1 and pFF2 when added to the IVM medium and in the presence of LH, FSH and EGF increased nuclear maturation (80%), cytoplasmic maturation increased between 371 and 400%, fertilization increased between 165 and 183% and polyspermy between 57 and 73%, as compared to the negative control. Since no significant differences were found between pFF of the two follicular types, pFF1 was selected to be fractionated by anionic exchange chromatography. Five fractions were obtained (R1, R2, R3, R4, R5), those with the most important effect were R1, R3 and R5. R1 increased fertilization by 30% and decreased polyspermy also by 30%, the latter one in the same manner as the complete pFF. R3 had an inhibitory effect on nuclear and cytoplasmic maturation. R5 increased the reinitiation of meiosis (29%), nuclear maturation (20%) and mPN development (32%).The fractions were analyzed by electrophoresis in polyacrylamide gel in presence of SDS to relate the protein band pattern to the effect on maturation, fertilization and polyspermy. In R1 a band of Mr from 45-46 kDa was found, this did not appear in other pFF fractions, for which it may be related to the reduction of polyspermy. R3 showed 2 bands (71 and 19 kDa) not present in the other regions, which may be related with its inhibitory effect. R5 showed two bands of 139 and 124 kDa not found in other fractions, these proteins may be implicated with the positive effect on maturation observed in pFF and in this region. This study shows that the protein components of pFF are relevant for the IVM, IVF and polyspermy of the porcine oocyte. It is required to perform analyses to identify the proteins that compose these fractions, so that in an isolated manner its effect can be tested in maturation media on IVM, IVF and polyspermy. Key words: in vitro maturation, in vitro fertilization, follicular fluid, follicular fluid protein fractions, porcine oocytes.
Los programas de maduración y fertilización in vitro (MIV y FIV) presentan problemas en los porcinos, estos son los bajos porcentajes de maduración citoplásmica y los altos índices de polispermia. Hasta la fecha no está claro si estas dificultades están relacionadas con las condiciones de cultivo durante la maduración. Se ha demostrado que el fluido folicular porcino (FFp) incrementa la maduración nuclear y citoplásmica del ovocito, evaluada por la formación del pronúcleo masculino (PNm) después de la FIV. Sin embargo, existe controversia sobre sus efectos dependiendo del tamaño del folículo del que proviene el FFp. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del FFp, completo y fraccionado, adicionado en el medio de maduración, en la MIV, FIV y la polispermia. Los ovocitos porcinos se obtuvieron de cerdas prepúberes. El FFp se obtuvo por la punción y aspiración de folículos menores de 5 mm (FFp1) y de 5.1 a 8 mm de diámetro (FFp2), el FFp de las dos categorías presentó una concentración de 60 ± 5 mg/ml de proteína. El testigo negativo se normalizó al 100%. Tanto el FFp1 como el FFp2 adicionados al medio de MIV y en presencia de LH, FSH y EFG aumentaron la maduración nuclear (80%), la citoplásmica se incrementó entre 371 y 400%, la fertilización entre 165 y 183% y la polispermia entre el 57 y 35% con relación al testigo negativo. Al no haber diferencia significativa entre el FFp de los dos tipos foliculares se eligió el FFp1 para fraccionarlo por cromatografía de intercambio aniónico. Se obtuvieron 5 fracciones (R1, R2, R3, R4, R5), y las que tuvieron un efecto más importante fueron R1, R3 y R5. La R1 incrementó la fertilización en un 30% y disminuyó la polispermia también en un 30%, esta última de la misma manera que el FFp completo. La R3 tuvo un efecto inhibitorio en la maduración nuclear y citoplásmica. La R5 incrementó el reinicio de la meiosis (29%), favoreció la maduración nuclear (20%) e incrementó la formación del PNm (32%). Las fracciones se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS para relacionar el patrón de bandas proteínicas con el efecto en la maduración, fertilización y polispermia. En la R1 se encontró una banda con Mr de 45-46 kDa que no apareció en otras fracciones del FFp por lo que puede estar relacionada con la disminución de la polispermia. La R3 presentó 2 bandas (71 y 19 kDa) no presentes en las otras regiones que pueden relacionarse con su efecto inhibitorio. La R5 presentó dos bandas de 139 y 124 kDa no encontradas en otras fracciones, estas proteínas pueden estar implicadas con el efecto positivo sobre la maduración que se observó con el FFp y esta región. Este trabajo demuestra que los componentes proteínicos del FFp son relevantes en la MIV y FIV y la polispermia del ovocito porcino. Se requiere realizar un análisis para identificar las proteínas que forman estas fracciones para que de manera aislada en los medios de maduración se pruebe su efecto sobre la MIV, FIV y polispermia. Palabras clave: maduración in vitro, fertilización in vitro, fluido folicular, fracciones proteínicas del fluido folicular, ovocitos porcinos
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