Diseño y aplicación de un sistema de detección basado en PCR para el género Listeria - Nuñez Armenta, Said Efren (Universidad Autónoma Metropolitana, 2016)
The Listeriosis is an alimentary sickness, with low frequence that may cause terrible medical deseases in a 30% of all the cases. The main bacteria is the Listeria monocytogenes, which has a high distribution in the nature where it can survive for a long period of time. The higher risk to be in touch for human race are all the food products, especially all those refrigerated under low degrees. In the food industry, the strain can survive in all cleaning and healthy procedures, cause it has a particular way to build a biofilm under the work surfaces and equipments, polluting the processed food. As a security way to control the growth of Listeria monocytogenes in processed foods and in the environment where food is processed, it has been studied the use of innovative products from plant and microbial origin to eliminate the pathogen. The listerie gender is divided in 6 species (Listeria monocytogenes L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, y L. grayi), where only the Listeria monocytogenes is a pathogenic strain for all humans. Is a Gram negative, facultative aerobiec or anaerobic bacteria, mobile at 25°C and inmobile at 37°C, it can survive at extreme temperaturas between 1°C and 45°C increasing at 37°C. it is considerated as a psicotrofic pathogen, that has the posibilliity to survive in cooling temperatures. However, the pH, is developed in a range between 4.4 and 9.4, it grows in a 10% of NaCl and can survive between 16% and 20% of this element. It can be found in a high percent at the terrestrial environment (soil, plants, waste water, stool), underwater environment and places where food is procesed. In food production plants can be found in soil, stagnant water processing equipment, conveyors, cold storage and freezing tunnels, among others. It development in this climate is favored by high humidity and the presence of nutriments. Even the pathogen doesn´t produce endosporas, has the capability to survive for a long period of time at the environment, food production plants and inside of domestic freezers. L. monocytogenes is a temporary resident intestinal in humans, because the 5% and 10% of the population at some point is a carrier, without symptoms. L. monocytogenes has been isolated in non-processed food like milk, raw meat, processed meat, raw and cold smoking fish. Even though to find it with high frequency in raw foods, all cases of Listeria generally al related with all whose are ready to consume, refrigerated food for long periods of time or all whose are Contaminated thermal post-processes. For this attachment, were designed 6 kinds of oligonucleotides to detect the 6 species of listeria gender, using the PCR multiplex in Real Time technique. For the development of oligonucleotides, was used the gene that codify the p60 listeria protein that has been cloned and sequenced. Due to at its possibility of invasion, the gene was called iap, because it’s a protein associated with invasion. The sequences to design oligonucleotides and probes were taken from the NCBI data base and were designed using a free software from the page https://www.idtdna.com/site, and verified by PCR in silico and PCR. The designed oligos evaluation were employed 51 strains, 33 belongs to Listeria gender, 14 from Escherichia coli, 2 from Citrobacter, 1 of Salmonella and 1 of Shigella ; all of them from ATCC collection and strains isolated from samples of plant products and identified the VITECK 2 Compact employee of Biomerieux equipment. The final results were satisfactory detecting the organism who it has been designed each one of all the oligos, so it says that the PCR technique is trustworthy identifying and detecting the gender of Listeria, which would reduce the analysis time instead of the conventional methods.; La Listeriosis es una enfermedad de origen alimentario de carácter grave, pero de baja frecuencia, que causa la muerte hasta en un 30% de los casos. La bacteria responsable, Listeria monocytogenes se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza donde puede sobrevivir por largos periodos de tiempo. El mayor peligro como fuente de contagio para el hombre son los alimentos, listos para el consumo, especialmente los que se conservan refrigerados por periodos prolongados. En la industria alimentaria el patógeno sobrevive, a los procesos de limpieza e higienización, por su capacidad de formar biopeliculas sobre superficies de trabajo y equipos, contaminando los alimentos que allí se procesan. Como una medida para el control del desarrollo de L. monocytogenes en los alimentos y en el ambiente donde se procesan los alimentos, se ha estudiado el uso de productos innovadores provenientes de plantas y de origen microbiano para eliminar al patógeno. El género Listeria se divide en seis especies (Listeria monocytogenes L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, y L. grayi), donde sólo L. monocytogenes es patógena para el hombre. Es una bacteria Gram positiva, aerobia o anaerobia facultativa, móvil a 25 ºC e inmóvil a 37 ºC, capaz de sobrevivir a temperaturas extremas entre 1 ºC y 45 ºC con un óptimo a 37 ºC. Se le considera un patógeno psicrótrofo, es decir, capaz de desarrollarse a temperaturas de refrigeración, lo cual le diferencia de otras bacterias patógenas como Salmonella o Staphylococcus aureus, que su crecimiento es inhibido a bajas temperaturas. En cuanto al pH, se desarrolla en un rango entre 4.4 y 9.4, crece en presencia de un 10% de NaCl y sobrevive, en presencia de esta sal, en un rango de 16 a 20%. Se encuentra ampliamente distribuida tanto en el ambiente terrestre (suelo, plantas, ensilaje, materia fecal, aguas residuales), en el ambiente acuícola y también en lugares donde se procesan alimentos. En plantas de producción de alimentos puede encontrarse en el suelo, aguas estancadas, equipos de procesamiento, cintas transportadoras, cámaras de frío y túneles de congelación, entre otros. Su crecimiento en este entorno se ve favorecido por la alta humedad y la presencia de nutrientes. Este patógeno, a pesar de no formar endosporas, es capaz de sobrevivir por largos periodos de tiempo en el medio ambiente, en las plantas procesadoras de alimentos y al interior de los refrigeradores domésticos. L. monocytogenes es un residente intestinal temporal en el ser humano ya que del 5% al 10% de la población en algún momento es portadora, sin presentar los síntomas. L. monocytogenes ha sido aislada de alimentos sin procesar como leche, carne y vegetales y de alimentos procesados como quesos suaves, helado, mantequilla, carne cruda, carne procesada, pescado crudo y ahumado en frío. A pesar de encontrarse con frecuencia en alimentos crudos, los casos de listeriosis generalmente se relacionan con aquellos alimentos listos para el consumo, los que se conservan refrigerados por un periodo prolongado de tiempo o con los contaminados post procesamiento térmico. Para este estudio se diseñaron 6 juegos de oligonucleotidos para la detección de las 6 especies del género Listeria empleando la técnica de PCR multiplex en tiempo Real. Para el desarrollo de los oligonucleotidos se empleó el gen que codifica para la proteína p60 de Listeria que ha sido clonado y secuenciado. Debido a su posible papel en la invasión, el gen fue nombrado iap (gen de virulencia) ya que es una proteína asociada a la invasión. Las secuencias para el diseño de los oligonucleotidos y las sondas se obtuvieron de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y se diseñaron empleando software libre de la página https://www.idtdna.com/site y se verificaron por PCR in silico y PCR- Punto fina. Para la evaluación de los oligonucleotidos diseñados se emplearon 51 cepas, 33 pertenecientes al género Listeria, 14 de Escherichia coli, 2 de Citrobacter, 1 de Salmonella y 1 de Shigella; Provenientes de la colección ATCC y cepas aisladas de muestras de productos vegetales e identificadas empleado el equipo VITECK 2 Compact de Biomerieux. (ver tabla 4) Los resultados obtenidos fueron satisfactorios al detectar al organismo para el que fueron diseñados cada par de oligonucleotidos, lo que demuestra que la técnica de PCR es confiable en la detección e identificación del género Listeria, lo que permitiría a su vez reducir el tiempo de análisis en comparación con los métodos convencionales.