Evaluación de métodos de inmovilización de enzimas para la construcción de biosensores Público Deposited

En esta investigación se describe la caracterización cinética y analítica de biosensores, elaborados sobre electrodos de tipo screen-printed (ESP) utilizando laccasa de Trametes versicolor, o tirosinasa mushroom como elementos de reconocimiento ambas son el atrapamiento, el reticulado y el enlace covalente en seis condiciones experimentales diferentes (ver Tabla I). Cada uno de ellos se caracteriza mediante Voltamperometría Cíclica, Espectroscopia Ultravioleta Visible, Amperometría y Microscopia Electrónica de Barrido (SEM). La caracterización electroquímica y espectrofotométrica se realiza a (30.0±0.5) °C y pH = 4.70 ±0.01 impuesto con amortiguador de acetatos 0.1 M, la constante de MichaelisMenten aparente (Km´), para la oxidación enzimática de hidroquinona (HQ) a p-quinona, (pQ), es usada como parámetro de comparación, ya que provee información tanto de los parámetros de la cinética enzimática como de los parámetros analíticos ligados directamente con el biosensor. Después de comparar los distintos métodos de inmovilización, se encuentra que el mejor método de inmovilización es el reticulado utilizando glutaraldehído al 2.5% a 40°C, obteniendo una Km´ de 170±3 µM, y un límite de detección de HQ de 17±6 µM, su tiempo de fabricación es de 1.5 horas y tiene un tiempo de vida > 5 meses almacenado a temperatura ambiente. Para analizar el efecto de la enzima sobre el método de inmovilización se fabricaron biosensores con las mismas condiciones experimentales mencionadas anteriormente utilizando ahora tirosinasa mushroom (Tm) como elemento de reconocimiento (Tabla II). Cada uno de estos biosensores fue caracterizado mediante Voltamperometría Cíclica, Espectroscopia Ultravioleta Visible, Amperometría, Espectroscopia de Impedancia Electroquímica (EIS) y Microscopía Electrónica de Barrido (SEM). De la caracterización amperométrica se obtiene la constante de Michaelis-Menten aparente, K´m, de cada biosensor, mientras que de las mediciones de la impedancia se obtiene la resistencia a la transferencia de carga, Rtc, de los biosensores caracterizados. Se encontró que el biosensor ESP/Tm/GA 2.5% tiene la K´m = (57±7) M y los valores de Rtc, más bajos, Con el fin de mejorar la transferencia electrónica, se diseñaron biosensores de tipo screenprinted con electrodos de trabajo de 0.7 cm2 de área, sin embargo la membrana polimérica al inmovilizar mediante atrapamiento y reticulado solo cubre el 30%, 70% y 100% del área del electrodo de trabajo. Utilizado LTv como elemento de reconocimiento se encuentra que los biosensores que tienen el 70% del área cubierta por la membrana polimérica, mejoran los parámetros cinéticos (Km´ y Imax) y los parámetros analíticos del biosensor (límite de detección, límite de cuantificación, sensibilidad, intervalo lineal, etc.) Usando los biosensores ESP/LTv/GA 2.5% y ESP/Tm/GA 2.5%, se determina la capacidad antioxidante equivalente a Trolox (TEAC) para las infusiones preparadas con Mirto (Salvia microphylla), Hierba San Cayetano (Solanum rudepannum), Muicle (Justicia spicigera), Hierba dulce (Lippia dulcis) y Salve Real (Lippia alba); plantas medicinales de uso común en México. En este trabajo se obtiene que Mirto es una planta rica en compuestos fenólicos para-sustituidos pues se obtiene un mayor TEAC al utilizar el biosensor de LTv, mientras que el resto de las infusiones estudiadas muestran una composición de compuestos orto- y meta-sustituidos mayor al obtener un TEAC mayor con el biosensor de Tm.

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  • 2014
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Última modificación: 09/27/2022
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