Síntesis de oligosacáridos fucosilados por vía enzimática mediante reacciones de fucosilación Público Deposited
The composition of human milk is very complex, has a large number of bioactive compounds, including oligosaccharides (OS). These compounds can be free or conjugated. The free OS are the third component of human milk after lactose and lipids, in recent decades, more than 130 OS have been isolated and identified. The OS of human milk play an important role in protection from infectious diseases, researches suggests that they are partly responsible for reducing the risk of infections in infants who are breastfed by favoring the growth of intestinal flora determined also are potent inhibitors of the adherence of pathogens on the epithelial surface of the intestine. There is now a growing interest in the ability of human milk OS, especially fucosyloligosaccharides to protect babies from enteric pathogens during early development. It is known that fucosyl-oligosaccharides have a link terminal α (1-2) have protective activity against Campylobacter jejuni and inhibit adhesion of Escherichia coli toxin. The biological importance of these compounds has generated interest, principally to produce and apply them in the food industry as a bioactive component in powder milk. There have been two main alternatives for the synthesis of OS, chemical synthesis and enzymatic synthesis. Despite the low yields obtained using glycosidases for the production of OS. An alternative is still studied as the chemical synthesis uses toxic solvents, and catalysts are not allowed in food regulation and the use of glycosyl-transferases is limited by low availability of the enzyme. The aim of this study was the synthesis of fucosylated oligosaccharides by fucosylation reactions using glycosyl-hydrolase exclusively. Reaction conditions were established for the synthesis of fucosyl-lactose by an enzymatic way, using hyperthermophilic β-glycosidase GLY 001-02 and α-fucosidase of Bos taurus using the PNP-F as a substrate donor and lactose as an acceptor substrate. Trisaccharide was obtained, which was subsequently hydrolyzed to known monosaccharides present in its structure and verify the presence of fucose. Furthermore, were established the reaction conditions for the synthesis of fucosylated disaccharides using α-galactosidase of "Beano", α-glucosidase of Saccharomyces cerevisiae and hyperthermophilic β-glycosidase GLY 001-02. We were synthesized eight different disaccharide: a disaccharide α-galactosyl-fucose using α-galactosidase of "Beano", melibiose and fucose as a donor and acceptor substrate, but it was impossible to purify for study; four disaccharides using α-glucosidase of Saccharomyces cerevisiae, using maltose as donor substrate and fucose as an acceptor substrate, these obtained in greater quantity was purified and identified by enzymatic hydrolysis as α-glucosyl-fucose; finally were synthesized three fucosylated disaccharides β-galactosyl-fucose, using hyperthermophilic β-glycosidase, using lactose as donor and fucose as an acceptor substrate, with probable prebiotic activity. Besides the presence of fucose in these OS is of great interest for further study microbial adhesion as this monosaccharide is recognized by adhesins of pathogenic bacteria. Synthesize fucosylated compounds was achieved by reaction fucosylation exclusively with hydrolases, using as donor substrate PNP-F as the acceptor substrate lactose, demonstrating the feasibility of the reaction. However, it is necessary to establish more efficient strategies that result in higher yields, as use of organic solvents or synthesis under saturated conditions of substrates to reduce the water activity and reaction fucosylation favor. The results generated great expectations and so far the studies on probiotics have focused on fructo-oligosaccharides and galacto-oligosaccharides, bypassing the OS of breast milk are known but its importance in the development of intestinal microbiota of infants, in addition to the high concentration of fucosylated oligosaccharides in breast milk suggests that they bring greater benefits to health.
La composición de la leche humana es muy compleja, posee una gran cantidad de componentes bioactivos entre ellos los oligosacáridos (OS), estos compuestos pueden estar en forma libre o conjugada. Los OS libres son el tercer componente de la leche materna tras la lactosa y los lípidos, en las últimas décadas, mas de 130 OS han sido aislados e identificados. Los OS de la leche humana desempeñan un papel importante en la protección de enfermedades infecciosas, las investigaciones sugieren que son en parte, responsables de la reducción del riesgo de infecciones en los lactantes que son alimentados con leche materna al favorecer el crecimiento de determinada flora intestinal, además son potentes inhibidores de la adhesión de patógenos en la superficie epitelial del intestino. En la actualidad existe un creciente interés en la capacidad de los OS de la leche humana, en especial los fucosil-oligosacáridos para proteger a los bebes de microorganismos patógenos entéricos durante el desarrollo temprano. Se sabe que los fucosil-oligosacáridos que poseen un enlace terminal α (1-2) tienen actividad protectora contra Campylobacter jejuni e inhiben la adhesión de la toxina de Escherichia coli. La importancia biológica de estos compuestos ha generado el interés de producirlos y aplicarlos principalmente en la industria alimentaria como componentes bioactivos en fórmulas lácteas. Se han planteado dos alternativas principales para la síntesis de OS, la síntesis química y la síntesis enzimática. A pesar de los bajos rendimientos obtenidos empleando glicosidasas para la producción de OS, sigue siendo una alternativa estudiada, ya que la síntesis química emplea solventes y catalizadores tóxicos no permitidos en la reglamentación alimentaria y el uso de glicosil-transferasas está limitado por la baja disponibilidad de la enzima. El objetivo de este trabajo fue estudiar la síntesis de oligosacáridos fucosilados a partir de reacciones de fucosilación mediante el uso exclusivo de glicosil-hidrolasas. Se establecieron las condiciones de reacción para la síntesis de fucosil-lactosa por vía enzimática, empleando βglicosidasa hipertermofílica GLY 001-02 y la α-fucosidasa de Bos taurus utilizando al PNP-F como sustrato donador y a la lactosa como sustrato aceptor. Se obtuvo un trisacárido que fue posteriormente hidrolizado para conocer los monosacáridos presentes en su estructura y comprobar la presencia de fucosa. También se establecieron las condiciones de reacción para la síntesis de disacáridos fucosilados empleando α-galactosidasa del producto comercial “Beano”, α-glucosidasa de Saccharomyces cerevisiae y la β-glicosidasa hipertermofílica GLY 001-02. Se consiguió sintetizar ochos diferentes disacárido: un disacárido α-galactosil-fucosa empleando αgalactosidasa del producto comercial “Beano”, melibiosa como sustrato donador y fucosa como aceptor, pero que no fue posible purificar para su estudio; cuatro disacáridos empleando α-glucosidasa de Saccharomyces cerevisiae, utilizando maltosa como sustrato donador y fucosa como aceptor, de estos el obtenido en mayor cantidad fue purificado e identificado mediante hidrólisis enzimática como α-glucosil-fucosa; por último se sintetizaron tres disacáridos fucosilados β-galactosil-fucosa, empleando β-glicosidasa hipertermofílica, utilizando lactosa como sustrato donador y fucosa como aceptor, con probable actividad prebiótica. Además la presencia de fucosa en estos OS es de gran interés para posteriores estudios de adhesión microbiana ya que este monosacárido es reconocido por las adhesinas de las bacterias patógenas. Se logró sintetizar compuestos fucosilados mediante reacción de fucosilación exclusivamente con hidrolasas, empleando como sustrato donador PNP-F y como sustrato aceptor lactosa lo que demuestra la viabilidad de la reacción. No obstante, es necesario establecer estrategias más eficientes que resulten en mayores rendimientos como el uso de solventes orgánicos ó la síntesis bajo condiciones de saturación de los sustratos para disminuir la actividad de agua y favorecer la reacción de fucosilación. Los resultados obtenidos generan excelentes expectativas ya que hasta ahora los estudios realizados sobre prebióticos se han centrado en los fructo-oligosacáridos y los galacto-oligosacáridos, dejando de lado a los OS de la leche materna que se conoce bien su importancia en el desarrollo de la microbiota intestinal de los lactantes, además la alta concentración de oligosacáridos fucosilados en la leche materna sugiere que estos aportan un mayor beneficio a la salud.
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