Long COVID, characterized by persistent multisystem symptoms after SARS-CoV-2 infection, is a serious disease that significantly impacts quality of life worldwide. To date, there is no treatment targeting its cause, only symptomatic management. For this reason, secondary metabolites such as the flavonoids hesperetin 7-rutinoside (H7R) and flavanone-7-O-glucoside (F7G) have been studied for their inhibitory potential against the Spike protein. This protein binds to the ACE2 receptor on the host cell through its receptor binding domain (RBD) and has been implicated as a possible contributor to Long-COVID. Therefore, the heterologous production of the Spike protein or its RBD domain is essential for interaction studies with the H7R and F7G flavonoids, which have shown, in silico and in vitro, the potential to inhibit the binding of the Spike protein to the ACE2 receptor. The aim of this work was the heterologous production of the RBD domain of the Spike protein in Escherichia coli BL21 (DE3), to generate a functional tool for future studies, such as ligand-binding determination using plasmon resonance. Cloning of gene of interest into the pTWIN1 plasmid was carried out by digestion with the restriction enzymes NdeI and XhoI, followed by ligation and transformation via the heat shock method in E. coli BL21 (DE3). The presence of the insert in the transformed colonies was verified by restriction analysis and PCR. Heterologous protein expression was induced with IPTG, and purification was performed by affinity using chitin magnetic beats. The RBD domain was successfully cloned in E. coli BL21 (DE3). Its expression was induced with 0.5 mM IPTG. Purification required prior treatment with urea due to the formation of inclusion bodies, which were attempt solubility. Purified protein was obtained, as evidenced by a band of approximately in 25 kDa on an SDS-PAGE; however, the protein concentration was low, possibly due to insufficient protein solubilization and/or the use of a rapid, small-scale purification method with chitin magnetic beads. Despite this, these results represent a valuable starting point for improving future strategies for RBD domain expression and purification.
El daño multisistémico persistente provocado por el virus del SARS-CoV-2, conocido como Long-COVID, es considerado una enfermedad grave que afecta la calidad de vida a nivel mundial. Hasta ahora, no existe un tratamiento dirigido a su causa, sino únicamente al manejo de sus síntomas. Por tal motivo, se han estudiado metabolitos secundarios, como los flavonoides hesperetin 7-rutinoside (H7R) y flavanone-7-O- glucoside (F7G), con potencial inhibitorio contra la proteína Spike, considerada un posible blanco terapéutico. Esta proteína se une al receptor ACE-2 de la célula hospedadora a través de su dominio de unión al receptor (RBD) y ha sido señalada como una posible responsable del Long-COVID. Por lo tanto, la producción heteróloga de la proteína Spike o de su dominio RBD resulta fundamental para estudios de interacción con los flavonoides H7R y F7G, que han mostrado, in silico e in vitro, capacidad para inhibir dicha unión. Es por esto por lo que el objetivo de este proyecto fue producir de manera heteróloga el dominio RBD de la proteína Spike en Escherichia coli BL21 (DE3), con el fin de generar una herramienta funcional para estudios posteriores, como determinación de la unión de ligandos por resonancia de plasmones. Se realizó la clonación del gen de interés en el plásmido pTWIN1, mediante digestión con las enzimas NdeI y XhoI, seguida de ligación y transformación por choque térmico en E. coli BL21(DE3). La inserción del gen se confirmó en las colonias transformadas mediante análisis de restricción y PCR. La expresión heteróloga de la proteína se indujo con IPTG, y su purificación se realizó por afinidad, utilizando perlas magnéticas recubiertas con quitina. Se logró, transformar E. coli BL21 (DE3), con el gen que codifica el dominio RBD, cuya expresión fue inducida con 0.5 mM de IPTG. La purificación requirió tratamiento previo con urea, debido a la formación de cuerpos de inclusión. Se obtuvo la proteína de interés purificada, evidenciada por una banda de aproximadamente 25 kDa en un gel SDS- PAGE, aunque con una concentración baja, posiblemente por poca solubilización de las proteínas o por tratarse de un método de purificación rápido y a pequeña escala con las perlas magnéticas recubiertas con quitina. Estos resultados constituyen una base para optimizar futuras estrategias de expresión y purificación del dominio RBD.
Relaciones
| En Conjunto Administrativo: |
|
|---|
Descripciones
| Nombre del atributo | Valores |
|---|
| Creador |
|
|---|
| Colaboradores |
|
|---|
| Tema |
|
|---|
| Editor |
|
|---|
| Idioma |
|
|---|
| Identificador |
|
|---|
| Palabra Clave |
|
|---|
| Año de publicación |
|
|---|
| Tipo de Recurso |
|
|---|
| Derechos |
|
|---|
| División académica |
|
|---|
| Línea académica |
|
|---|
| Licencia |
|
|---|
