Regulación de Cas9 por las proteínas virales Tat y Rev para la inactivación del VIH-1 - Vergara Mendoza, Moisés (Universidad Autónoma Metropolitana, 2020)
Introducción. Desde la identificación del Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (VIH-1) y del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), se ha desarrollado un gran número de estrategias para combatir la infección, entre las cuales destaca por su eficacia el uso de los fármacos antirretrovirales. La terapia antirretroviral combinada (TARc) ha tenido un gran impacto en el tratamiento de la infección por el VIH-1; sin embargo, los problemas persistentes durante la infección, como la inflamación crónica, la activación inmunológica persistente, la formación del reservorio, la latencia viral, la resistencia y los efectos secundarios de los antirretrovirales, han conducido al diseño de nuevas estrategias dirigidas a erradicar al reservorio viral. La edición del genoma mediante el sistema CRISPR/Cas9 se ha convertido en una herramienta eficaz para eliminar la infección por VIH-1 o para prevenir su replicación, debido a su fácil programación que depende de un ARN guía (ARNg) que le permite identificar a una secuencia específica del ADN e inducir un corte doble. Además, cuando se seleccionan a más de un ARNg se puede escindir al ADN en varios fragmentos. No obstante, existen riesgos inherentes a la edición génica como la posibilidad de inducir mutaciones inespecíficas y que limitan la aplicación de estas estrategias moleculares en humanos, hasta establecer protocolos seguros. La selección de blancos específicos mediante el uso de programas bioinformáticos y la inducción de mutaciones únicamente en las células infectadas, pueden ayudar a que la terapia génica basada en CRISPR/Cas9 sea segura, fácil y personalizada, evitando poner en riesgo la integridad de las células sanas. Objetivo. Controlar la expresión de Cas9 con las secuencias reguladoras LTR, INS y RRE, e inducir su expresión en presencia del virus y dirigir mutaciones a los genes reguladores tat y rev para autorregular al sistema e inactivar al VIH-1. Metodología. En este estudio, se aislaron las secuencias reguladoras LTR, INS y RRE del VIH-1 y se usaron para controlar la expresión de Cas9 en células HEK293. Se diseñaron ARNg para inducir mutaciones en las regiones conservadas de los genes reguladores tat y rev del VIH-1. Para verificar el efecto de los ARNg en la replicación viral, se evaluó el sistema pLCI-ARNg diseñado en un modelo de partículas de VIH-1 pseudotipado con VSV-G. Resultados. Se demostró la autorregulación de la expresión del gen de Cas9 en presencia de las proteínas virales Tat y Rev y se comprobó la escisión de un fragmento de 2500 pb con una eficiencia del 90% y que incluye a los genes tat, rev y env del VIH-1. La concentración de la proteína p24 de la cápside viral en sobrenadantes de cultivo disminuyó hasta niveles indetectables cuantificados por un ensayo de ELISA, lo que sugiere la cura funcional del cultivo celular. Los ARNg diseñados confieren protección a las células en presencia del VIH-1, manteniendo la viabilidad y la proliferación celular. Conclusiones. Se desarrolló una estrategia efectiva para regular la expresión de Cas9 cuya activación depende de las proteínas virales Tat y Rev mediante la adición de las secuencias reguladoras LTR e INS-RRE del VIH-1, además de la autorregulación proporcionada por los ARNg. La edición múltiple dirigida a los genes tat y rev sugiere que es una estrategia confiable y precisa para eliminar la infección in vitro por el VIH-1 y cuyo efecto se restringe a las células infectadas.