Producción y purificación de β-N-acetilhexosaminidasa en cultivo sumergido de Lecanicillium lecanii inmovilizado en espuma de poliuretano Público Deposited

The aim of this study was the production in submerged culture of the enzyme Nacetylhexosaminidase (Nhase) of the entomopathogenic fungus Lecanicillium lecanii immobilized in polyurethane foam and its purification. In a previous work, the conditions of immobilization and production were established (Carrasco et al., 2009), tested two purification protocols Initially kinetics of Nhase activity were carried out in a bioreactor using bioparticles and spores (free cells) as inocula, the former yields a maximum volumetric activity of 48.82± 6.14 U/L, whereas the latter was 11.2 ± 0.26 U/L i.e. more than fourfold the activity with bioparticules. The highest specific activity was also found when the bioparticles was used as inoculum (0.25±0.07 U/mg protein). Indeed, the highest Nhase/g of initial solid substrates (SSI) activity was determined in the culture using bioparticles (2.73 ± 0.34 U/gSSI), compared with the culture inoculated with spores (0.62 ± 0.014 U/gSSI). Purification of Nhase from crude enzymatic extract of submerged culture with bioparticles was carried out. Proteins were salted out at 40% saturation with ammonium sulfate obtaining a specific activity of 4.22 ± 0.6 U/mg, the supernatant was brought to 80% saturation with ammonium sulfate (2±0.18 U/mg). Each of these fractions were injected into a size exclusion chromatography column (Sephacryl™ S-100 High Resolution), obtaining specific activities of 7.92 U/mg and 0.44 U/mg with purification factor of 2.55 and 0.14 for the fraction precipitated at 40 and 80% saturation, respectively. Subsequently, the fractions with activity were subjected to ion exchange chromatography (Macro-Prep High Q support), nevertheless there was not a good separation and above all the enzymatic activity was absent. Based on the above, the purification protocol was modified, Nhase activities were determined as 88.2±10.78 Nhase U/mg protein, 16.58±2.26 U/mg The aim of this study was the production in submerged culture of the enzyme Nacetylhexosaminidase (Nhase) of the entomopathogenic fungus Lecanicillium lecanii immobilized in polyurethane foam and its purification. In a previous work, the conditions of immobilization and production were established (Carrasco et al., 2009), tested two purification protocols Initially kinetics of Nhase activity were carried out in a bioreactor using bioparticles and spores (free cells) as inocula, the former yields a maximum volumetric activity of 48.82± 6.14 U/L, whereas the latter was 11.2 ± 0.26 U/L i.e. more than fourfold the activity with bioparticules. The highest specific activity was also found when the bioparticles was used as inoculum (0.25±0.07 U/mg protein). Indeed, the highest Nhase/g of initial solid substrates (SSI) activity was determined in the culture using bioparticles (2.73 ± 0.34 U/gSSI), compared with the culture inoculated with spores (0.62 ± 0.014 U/gSSI). Purification of Nhase from crude enzymatic extract of submerged culture with bioparticles was carried out. Proteins were salted out at 40% saturation with ammonium sulfate obtaining a specific activity of 4.22 ± 0.6 U/mg, the supernatant was brought to 80% saturation with ammonium sulfate (2±0.18 U/mg). Each of these fractions were injected into a size exclusion chromatography column (Sephacryl™ S-100 High Resolution), obtaining specific activities of 7.92 U/mg and 0.44 U/mg with purification factor of 2.55 and 0.14 for the fraction precipitated at 40 and 80% saturation, respectively. Subsequently, the fractions with activity were subjected to ion exchange chromatography (Macro-Prep High Q support), nevertheless there was not a good separation and above all the enzymatic activity was absent. Based on the above, the purification protocol was modified, Nhase activities were determined as 88.2±10.78 Nhase U/mg protein, 16.58±2.26 U/mg nd 1.69±0.3 U/mg for precipitates of 40, 60 and 80% of saturation with ammonium sulfate, respectively. The accumulated enzyme activity in the precipitates with ammonium sulfate among 60 and 80% did not show significant differences, thus for the further work it was employed 60% saturation. Precipitated fraction was dissolved in Tris-HCl 50mM, NaCl 0.15M buffer pH 7.8 and ultrafiltrate (molecular weight cut off 10 KDa). The retentate was mixed up with 4% (v/v) Triton X-100 and 10% (v/v) acetonitrile and injected into size exclusion chromatography column (Sephacryl™ S-100 High Resolution). The fractions with activity were 10 (0.88 U/mg U/mg protein) and 11 (1.98 U/mg U/mg), with a purification factor of 72.12 and 162.16, respectively. Fractions 10 and 11 were injected in an ion exchange column (DEAE-Sepharose fast-flow). Fractions with Nhase activity were subjected to SDS-PAGE, showing only two bands between 50-75 KDa for fractions 20-30, fractions 31-33 observed a single band for the fraction 10 and also a single band in fractions 30-36 for the fraction 11. The purification of Nhase from a crude enzymatic extract of the immobilized Lecanicilliun lecanii was achieved after only three steps of purification. The purified Nhase is most active at pH 40°C and 6.0

El objetivo del presente trabajo fue producir y purificar la enzima Nacetilhexosaminidasa (Nhasa) a partir de un cultivo sumergido del hongo Lecanicillium lecanii inmovilizado en espuma de poliuretano, para lo cual se utilizaron las condiciones reportadas por Carrasco y col. (2009) y se probaron dos protocolos de purificación. Inicialmente, se llevó a cabo la cinética de producción Nhasa, para lo que se utilizaron, como inóculo, biopartículas (hongo inmovilizado) en un biorreactor y como control se utilizaron esporas libres. Se encontró que la actividad volumétrica al utilizar biopartículas fue cuatro veces mayor (48.82±6.14 U/L), con respecto al control (11.2±0.26 U/L). De igual modo la mayor actividad específica se obtuvo al utilizar como inóculo las biopartículas obteniéndose 0.25±0.07 U/mg de proteína, mientras que, al inocular el reactor con esporas, solo fue de 0.028±0.0007 U/mg de proteína. En cuanto a la actividad Nhasa/g de sustratos sólidos iniciales (SSI), la mayor actividad se obtuvo en el cultivo con las biopartículas (2.73±0.34 U/gSSI) a diferencia del cultivo inoculado con esporas (0.62±0.014 U/gSSI). Posteriormente, se diseño una estrategia de purificación de una Nhasa a partir del extracto crudo enzimático obtenido del cultivo sumergido inoculado con biopartículas. Para tal fin, se precipitaron las proteínas con 40% de saturación con sulfato de amonio, obteniendo una actividad específica de 4.22±0.6 U/mg de proteína, el sobrenadante se llevo hasta 80% de saturación, obteniéndose en este segundo precipitado una actividad específica de 2±0.18 U/mg de proteína. Los precipitados de 40 y 80% fueron inyectados en una columna de exclusión molecular (Sephacryl™ S-100 High Resolution), separándose fracciones con actividades específicas de 7.92 U/mg y de 0.44 U/mg con factores de purificación de 2.55 y 0.14 para los precipitados al 40% y 80% de El objetivo del presente trabajo fue producir y purificar la enzima Nacetilhexosaminidasa (Nhasa) a partir de un cultivo sumergido del hongo Lecanicillium lecanii inmovilizado en espuma de poliuretano, para lo cual se utilizaron las condiciones reportadas por Carrasco y col. (2009) y se probaron dos protocolos de purificación. Inicialmente, se llevó a cabo la cinética de producción Nhasa, para lo que se utilizaron, como inóculo, biopartículas (hongo inmovilizado) en un biorreactor y como control se utilizaron esporas libres. Se encontró que la actividad volumétrica al utilizar biopartículas fue cuatro veces mayor (48.82±6.14 U/L), con respecto al control (11.2±0.26 U/L). De igual modo la mayor actividad específica se obtuvo al utilizar como inóculo las biopartículas obteniéndose 0.25±0.07 U/mg de proteína, mientras que, al inocular el reactor con esporas, solo fue de 0.028±0.0007 U/mg de proteína. En cuanto a la actividad Nhasa/g de sustratos sólidos iniciales (SSI), la mayor actividad se obtuvo en el cultivo con las biopartículas (2.73±0.34 U/gSSI) a diferencia del cultivo inoculado con esporas (0.62±0.014 U/gSSI). Posteriormente, se diseño una estrategia de purificación de una Nhasa a partir del extracto crudo enzimático obtenido del cultivo sumergido inoculado con biopartículas. Para tal fin, se precipitaron las proteínas con 40% de saturación con sulfato de amonio, obteniendo una actividad específica de 4.22±0.6 U/mg de proteína, el sobrenadante se llevo hasta 80% de saturación, obteniéndose en este segundo precipitado una actividad específica de 2±0.18 U/mg de proteína. Los precipitados de 40 y 80% fueron inyectados en una columna de exclusión molecular (Sephacryl™ S-100 High Resolution), separándose fracciones con actividades específicas de 7.92 U/mg y de 0.44 U/mg con factores de purificación de 2.55 y 0.14 para los precipitados al 40% y 80% de 6

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