Identificación de proteínas que se unen a coumestrol en la membrana de enterocitos de yeyuno en ratón adulto CD1 - León Ortiz, Pablo (Universidad Autónoma Metropolitana, 2014)
El proceso reproductivo de los animales requiere de la energía que se obtiene de los alimentos. Sin embargo, en ellos también pueden estar presentes compuestos que interfieren potencialmente con la fisiología y control de la reproducción. Tal es el caso de los fitoestrógenos, compuestos de origen vegetal estructuralmente similares a las hormonas esteroides con capacidad de interactuar con los receptores a estrógenos (ERs) y promover o inhibir la respuesta fisiológica a los estrógenos. Una de las funciones características de las membranas celulares es la permeabilidad selectiva que permite el intercambio controlado de substratos iones y moléculas específicas. En la membrana de las células existen varias proteínas encargadas de transportar y facilitar el movimiento de moléculas lipófilicas, como colesterol, vitaminas A, D o polifenoles. Ejemplos de ellas son, la proteína transportadora NPC1L1, SR-B1, la translocasa de grasas CD36, además de cuatro miembros de la familia de proteínas transportadoras caracterizadas por tener un casete de unión a ATP: ABCA1, ABCG1, ABCG5 y ABCG8. En el suero y líquido intercelular, se presentan otro tipo de proteínas capaces de unir compuestos lipofílicos incluyendo la globulina que une hormonas sexuales estradiol y testosterona (SHBG), la globulina de unión de corticosteroides (CBG) y la globulina unidora de tiroxina (TBG). Además de estos transportadores específicos, algunos otros como, la albúmina son capaces de unir una amplia variedad de compuestos incluyendo esteroides, diferentes fitoquímicos y xenobióticos. El transporte a través del epitelio intestinal del Coumestrol se ha tomado como un proceso equivalente e incluso similar al de las substancias lipófilicas como el colesterol. Aunque, no hay evidencias de que esto sea cierto. El objetivo del presente estudio fue identificar la presencia de componentes proteicos aislados de las membranas celulares de los enterocitos de ratón adulto CD1 con capacidad de unirse al coumestrol de manera aislada. Se diseñaron y optimizaron varias metodologías que permitieran obtener e identificar a este tipo de proteínas. Se utilizaron 20 ratones a los cuales se les extrajo la porción del yeyuno del intestino delgado; después de hacer una inversión del túbulo intestinal para exponer los enterocitos, se separó el material en digestión y el recubrimiento de mucina. La separación mecánica del epitelio se realizó en amortiguador con citrato de sodio. Los enterocitos se obtuvieron por digestión del epitelio con colagenasa. Las proteínas de membrana se solubilizaron con Triton X100. El detergente se retiró precipitando las proteínas totales con acetona fría. Las proteínas precipitadas se reconstituyeron en micelas de duodecilsulfato de sodio y se separaron electroforéticamente en geles de poliacrilamida al 8%. La detección de las proteínas que se unen al coumestrol, se realizó utilizando una solución metanólica al 50 % con Coumestrol 50 μg/mL. Las proteínas que unen coumestrol con menor afinidad permanecen visibles al retirar el exceso con metanol. Aquellas que lo hacen con mayor eficiencia permanecen visibles, a pesar de emplear ácido acético al 10%. Para establecer la complejidad de la membrana del enterocito, los mismos geles fueron teñidos con azul de Coomassie y con nitrato de plata. Utilizando esta metodología se detectaron una gran cantidad de proteínas que pueden unir de manera inespecífica al coumestrol. Aún en la preparación comercial de albúmina sérica bovina fracción V del método de Cohn se observan al menos 2 números de componentes una vez que se ha retirado el exceso de coumestrol con el solvente primario. Si se rehidrata el gel con amortiguador o agua, la unión se conserva. Esta unión enmascara la unión más fuerte que tiene una proteína con peso molecular relativo (MWr) de 24,594 Daltones a la que hemos denominado p25. Está proteína puede visualizarse cuando se deja el gel teñido con coumestrol en una solución de ácido acético al 10%. La banda de proteínas identificada presenta un peso molecular totalmente distintivas que no permiten asociarlas con aquellas que se han reportado asociadas al transporte de colesterol, vitaminas liposolubles o mediando la saturación lipídica de las lipoproteínas del tipo de las LDL. Mientras que la proteína NPC 1L1 tiene un peso molecular de 146.6 kDa, la CD36 88 kDa y la SR-B1 de 80 kDa. De la misma forma, la diversidad en la localización de los diferentes transportadores no permite una asociación específica; mientras que NPC1 es la principal reguladora de lípidos en la membrana celular de los enterocitos y la membrana canalicular de los hepatocitos, otros transportadores son intracelulares; el enclave de la proteína p25 está restringida a la membrana celular como lo indica el uso de concentraciones importantes de detergente utilizado para su extracción. La identificación de una banda de proteínas abre la posibilidad de realizar estudios específicos de proteómica tanto estructural como funcional.; Animal reproductive process requires the energy from foodstuff. However, food may also contain compounds that could interfere with the general physiology and especially on the reproductive control as is the case of phytoestrogens, plant derived compounds structurally similar to steroid hormones and capable to interact with the estrogen receptors (ER) to promote or inhibit the physiological response to estrogens. One characteristic function of cell membrane is their selective permeability allowing the exchange of specific ions and molecules. There are several proteins in the cell membrane endowed to the transport and facilitation of lipophilic molecules as cholesterol, Vitamin A, D or polyphenolic as is the case of the transport NPC1L1 protein, SR-B1, the Fat translocator CD36 along with 4 members of the ATP binding cassette characteristic transport protein: ABCA1, ABCG1,ABCG5 and ABCG8. In sera and intercellular liquid there are also several types of lipophilic binding protein transporters including the sex hormone, estradiol and testosterone, binding globulin (SHBG), the corticosteroid binding globulin (CBG), and the tiroxin binding globulin (TBG). Another unspecific transporter in serum has also been described, like Albumin capable to bind a wide range of compounds including steroids, phytochemicals and xenobióticos. Coumestrol transport through the intestinal epithelium has been taken as an equivalent process or even similar to those described for structurally similar lipophilic substances like cholesterol, even though there are no clear evidence for this assumption. The goal of the present study was to identify some components from the enterocytes membrane of adult CD1 mice capable to bind coumestrol. Several techniques were developed and standardized that in conjunction allow us to obtain and identify this kind of proteins. Jejune portion of the small intestine of 20 CD1 adult mice were used. After the jejune tubular inversion to expose the enterocytes layer, content was removed along with the mucin layer by exhaustive washing in saline solution. Mechanical disruption of the epithelia was achieved in citrate containing buffer incubation. Isolated enterocytes were obtained by collagenase digestion of the epithelia. Membrane proteins were extracted by using Triton X100-containing saline. Detergent was removed by cold acetone protein precipitation. Precipitated proteins were renatured into SDS and electrophoretically fractionated in 8% polyacrylamide gels. Coumestrol binding protein detection was made using a methanol Coumestrol solution. Those low affinity coumestrol binding proteins were still visible after excess coumestrol was removed by methanol incubation. The highly efficient coumestrol binding proteins were detected after a 10% Acetic acid incubation. In order to obtain the protein complexity of the enterocytes membrane proteins, gels were stained with both Coomassie brilliant blue and silver. Using this methodology, several proteins capable to bind coumestrol were detected. Even in the commercial BSA Cohn´s fraction V preparation has least 2 components that can be visualized after excess coumestrol removal. These components are visualized even in hydrated gels no matter if they are incubated in buffer or water. These components do not permit to identify the more stable and possibly higher affinity binding of coumestrol to a 24 594 Da protein that is now nominated as p25. This protein band can be visualized when the coumestrol-stained gel is incubated in 10% acetic acid. This band has different characteristics to neither those found in the already identified phytochemical and xenobiotic-binding proteins nor those involved in cholesterol transport. While NPC1L1 a 146.6 kDa proteins, CD36 an 88 kDa, and 80 kDa for SR-B1, the proteins that can be identified by coumestrol binding has a lower MW. The diversity in the final location of the cholesterol and lipophilic transporters do not allows a positive association; whereas NPC1L1 is the main cholesterol regulator in the cell membrane of enterocytes and the liver canalicular membrane, some others transporters are intracellular; p25 is apparently restricted to the cell membrane as indicated by the high detergent concentration used for extraction. The identification of a protein band opens the possibility for specific structural and functional proteomic studies.