Los factores transcripcionales AP-1 son proteínas de unión a ADN del tipo bZIP (cremallera de leucina), que activan la transcripción en respuesta a diferentes estímulos, y están conservados en organismos eucariotas desde hongos a humanos. En Sacharomyces cerevisiae se han descrito varias proteínas del tipo AP-1, como las proteínas Yap, un grupo de 8 factores transcripcionales, y entre ellas Yap1, que participa en la resistencia a varios compuestos tóxicos y al peróxido de hidrógeno. En hongos filamentosos se han identificado proteínas homólogas a las proteínas Yap, como por ejemplo AfY AP1 de Aspergillus fumigatus, principal regulador en la respuesta de defensa contra especies reactivas de oxígeno en este hongo, o RsmA de Aspergil/us nidulans, que posee sitios de unión específicos en el promotor del regulador de los genes de esterigmatocistina. En Aspergil/us parasiacus se ha identificado el factor transcripcional AtfB, no perteneciente al tipo AP-1 , que regula la tolerancia conidial al estrés oxidativo y se une a los promotores de siete genes del cluster de biosíntesis de aflatoxina. Existe cada vez mayor evidencia de que hay una relación estrecha entre la respuesta al estrés oxidativo y el metabolismo secundario En Penicillium chrysogenum, el factor transcripcional Pta1 se une a la secuencia TTAGTAA en el promotor del gen de biosíntesis de penicilina pcbAB. Esta secuencia es idéntica o muy similar a las secuencias de unión de factores de transcripción de tipo Yap. Mediante una búsqueda en la base de datos GenBank hemos encontrado en el genoma de P. chrysogenum genes presuntamente homólogos de los genes que codifican AfYap1 , RsmA y AtfB en especies de Aspergillus. El objetivo de este proyecto es expresar los genes codificantes de los factores transcripcionales PcYap1 , RsmA y AtfB de Penicillium chrysogenum en Pichia pastoris como proteínas de fusión a His-tag, y purificarlos para su utilización posterior en análisis de unión a secuencias reguladoras del promotor pcbAB. A partir de ADN genómico de P. chrysogenum se amplificaron mediante PCR los genes PcYap1 , RsmA y AtfB, y a partir de ellos se obtuvieron sus secuencias codificantes (CDS), mediante PCR recombinante en el caso de RsmA, RT-PCR en el caso de PcYap1 , y PCR convencional para AtfB. Las CDS de estos genes se clonaron en el vector de expresión pPICZ, obteniéndose los plásmidos pPICZ-A/PcYap1 , pPICZ8/RsmA y pPICZ-8/AtfB, los cuales fueron transformados por electroporación en Pichia pastoris. Para la obtención de las proteínas recombinantes heterólogas se cultivaron los transformantes de P. pastoris, seleccionados por fleomicina , que portaban cada uno de los plásmidos, utilizando metano! como inductor. La extracción de proteínas heterólogas intracelulares se realizó después de 72 horas de incubación, y se purificaron por cromatografía de afinidad usando un gradiente de imidazol. Finalmente se analizaron las fracciones eluídas en geles de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes (SDSPAGE). En el caso de la proteína PcYap1 , fusionada al epítopo c-myc y la cola de 6 histidinas, se esperaba un peso molecular de 66 kDa de acuerdo a la secuencia aminoacídica de la proteína de fusión , tamaño que se observó en los geles SDS-PAGE en una banda parcialmente purificada en la fracción correspondiente a la elución con 500 mM de imidazol. Para RsmA se esperaba una proteína de fusión de 35 kDa, la cual se detectó en los geles desde la fracción de la elución con 200 mM de imidazol, y purificada en la fracción eluída con 500 mM. En el caso de AtfB se esperaba una proteína de fusión de 38 kDa, que fue detectable en gel desde la elución con 200 mM de imidazol, y purificada en la elución con 500 mM de imidazol. Estas proteínas purificadas se utilizarán para realizar ensayos mediante la técnica EMSA, donde se analizará la unión de estas proteínas a secuencias reguladoras del promotor pcbAB.
Transcriptional factors AP-1 are bZIP (leucine zipper) DNA binding proteins that activate transcription in response to different stimuli, and are conserved in eukaryotes from fungi to humans. In Saccharomyces cerevísíae several types of AP-1 proteins have been described, such as Yap proteins, a group of 8 transcription factors, and among them Yap1 , which participates in resistance to various toxic compounds and hydrogen peroxide. In filamentous fungi, proteins homologous to S. cerevísíae Yap proteins have been identified, such as Aspergíllus fumígatus AfYap1 , the main regulator in defense response against reactive oxygen species in this fungus, or RsmA from Aspergíllus nidulans, which has specific binding sites in the promoter of the sterigmatocystin cluster regulator. In Aspergi/Jus parasiticus, transcriptional factor AtfB, which does not belong to type AP-1 , was identified as a regulator of conidial oxidative stress tolerance and it binds to seven gene promoters in the aflatoxin biosynthesis cluster. There is a growing body of evidence about a close relationship between oxidative stress response and secondary metabolism in fungí. In Penícillium chrysogenum, transcription factor Pta1 binds to a TTAGTAA sequence in the pcbAB penicillin biosynthesis gene prometer. This sequence is identical or very similar to the binding sequences for transcription factors of the Yap type. By searching the GenBank database we found in the P. chrysogenum genome putative orthologs to genes encoding AfYap1 , RsmA and AtfB in Aspergillus species. The aim of this project was the expression of the genes encoding the transcription factors PcYap1 , AtfB and RsmA of Penicillium chrysogenum in Pichia pastoris as fusion proteins to His-tag, and their purification for subsequent use in binding assays to pcbAB promoter regulatory sequences. From genomic DNA of P. chrysogenum, the PcYap1, RsmA and AtfB genes were amplified by PCR. The coding sequences (CDS) of the genes were obtained by difterent methods: recombinant PCR for RsmA, RT-PCR for PcYap1 , and conventional PCR for AtfB. The CDS of each gene was cloned into the expression vector pPICZ, yielding plasmids pPICZ-A/PcYap1, pPICZ-B/RsmA and pPICZ-B/AtfB, which were transformed into Pichia pastoris by electroporation. For heterologous recombinant protein production, P. pastoris transformants carrying each of the plasmids were cultured and selected by phleomycin, using methanol as inductor. Extraction of intracellular heterologous proteins was performed atter 72 hours of incubation, and purification was performed by affinity chromatography using an imidazole gradient. Finally, the eluted fractions were analyzed on polyacrylamide gels under denaturing conditions (SDS-PAGE). In the case of the PcYap1 protein fused to the c-myc epitope and 6-histidine tail, a molecular weight of 66 kDa was expected according to the amino acid sequence of the fusion protein; a band of this size was observed partially purified in the fraction corresponding to the elution with 500 mM imidazole in SDS-PAGE gels. For RsmA, a fusion protein of 35 kDa was expected; a protein of this molecular weight was detected in the gels from the fraction eluted with 200 mM imidazole, and purified in the fraction eluted with 500 mM . In case of AtfB, a fusion protein of 38 kDa was expected, which was detected in the gel from the fraction eluted with 200 mM imidazole, and purified with 500 mM imidazole elution. These purified proteins will be used for EMSA (Electrophoretic Mobilkity Shift Assay), in which the binding of these proteins to pcbAB promoter regulatory sequences will be analyzed .
Relaciones
| En Conjunto Administrativo: |
|
|---|
Descripciones
| Nombre del atributo | Valores |
|---|
| Creador |
|
|---|
| Colaboradores |
|
|---|
| Tema |
|
|---|
| Editor |
|
|---|
| Idioma |
|
|---|
| Palabra Clave |
|
|---|
| Año de publicación |
|
|---|
| Tipo de Recurso |
|
|---|
| Derechos |
|
|---|
| División académica |
|
|---|
| Línea académica |
|
|---|
| Licencia |
|
|---|
