Cultivo en medio sólido de levaduras de Kluyveromyces marxianus en soportes sintéticos y naturales usando lactosa como fuente de carbono y energía Público Deposited

El suero de leche es el principal coproducto de la industria quesera, puede causar problemas ambientales si no es tratado adecuadamente. Entre varias alternativas biotecnológicas, las levaduras del género Kluyveromyces pueden utilizar la lactosa como fuente de carbono y energía para la producción de biomasa y enzimas de interés industrial. Por otra parte, debido a las características del cultivo en medio sólido (CMS) resulta interesante desarrollar un estudio fundamental sobre el crecimiento y fisiología de Kluyveromyces en este sistema de cultivo. En este sentido, usando un sistema modelo con espuma de poliuretano como soporte, se determinó el efecto del nivel de inóculo, el uso de amortiguadores de pH, el origen de la fuente de nitrógeno y la concentración de lactosa y nutrientes sobre las variables principales del CMS de Kluyveromyces marxianus (fases de retardo, tasas de actividad respiratoria, CO2 total formado, biomasa, consumo de lactosa, rendimientos de biomasa y de actividades enzimáticas). Se estudiaron las cepas UCDCC 351, NCYC 587, 1109, 1429, CDBBL 278 y Agua Miel A1. Asimismo, se llevaron a cabo estudios preliminares del cultivo de K. marxianus sobre bagazo de caña de azúcar y rastrojo de sorgo impregnados con suero de leche industrial en un reactor de charolas y en reactor agitado por listones helicoidales. Se llevaron a cabo estudios para determinar las condiciones de cultivo de K. marxianus CDBBL 278 en medio sólido empleando espuma de poliuretano como soporte inerte, el cual fue impregnado con medio de cultivo conteniendo lactosa. El seguimiento de las diferentes fases de crecimiento de esta levadura se llevó a cabo por respirometría, seleccionando el nivel de inoculación de 2.5x106 células por gramo de materia seca (gms) para estudios posteriores. Al llevar a cabo CMS con esta levadura empleando dos amortiguadores de pH: amortiguador de acetatos de sodio y amortiguador de fosfatos de potasio, no hubo diferencia significativa en el pH final del cultivo. Se observó una diferencia significativa (ð<0.5) en la producción de biomasa (53±0.1 mg/gms), rendimiento celular (0.36±0.01) y consumo de lactosa (90 %) cuando se empleó el amortiguador de fosfatos en el medio de cultivo y por esto fue seleccionado para estudios posteriores. Al estudiar la adición de mezclas de sulfato de amonio y urea no se logró regular el pH en los cultivos, sin embargo, bajas concentraciones de urea (20 % del NT) favorecieron la actividad enzimática tanto de lactasa como de inulinasa para todas las cepas estudiadas (UCDCC 351, NCYC 587, NCYC 1109, NCYC 1149, CDBBL 278 y Agua Miel A1). Las cepas NCYC 587 y CDBBL 278 presentaron los mayores títulos de actividad lactasa e inulinasa, respectivamente, cuando 20 % de la fuente de nitrógeno provino de urea (2038.3 y 241.6 UI/gX, respectivamente) y por ello fueron seleccionadas para estudiar el efecto del aumento en la concentración de lactosa así como de todos los nutrientes del medio en el CMS de K. marxianus. La máxima producción de biomasa para las cepas NCYC 587 y CDBBL 278 (71.7±5.1 y 95.8±5.1 mg/gms, respectivamente) se obtuvo con la mayor concentración de lactosa presente en el medio de 150 g/L. La mayor tasa de actividad respiratoria (0.3±0.003 y 0.4±0.001 h-1 , respectivamente), así como el mayor consumo de lactosa y rendimiento de biomasa (91.4±0.3 % y 0.36±0.01 mg/gms, respectivamente) se obtuvo con una concentración de lactosa de 50 g/L, para ambas cepas. Al emplear el suero de leche fresco como sustrato, éste amortiguó el pH en el cultivo de K. marxianus NCYC 587 y CDBBL 278, con un consumo casi total de lactosa (99±1.2 y 98±1.1 %, respectivamente) y rendimientos similares a los reportados en la literatura para estas levaduras (0.32±0.06 y 0.33±0.03, respectivamente) en CML. Las cepas de Kluyveromyces marxianus NCYC 587 y CDBBL 278 fueron capaces de crecer sobre bagazo de caña de azúcar y rastrojo de sorgo como soportes naturales empleando suero de leche industrial. Con la cepa CDBBL 278 se llevaron a cabo CMS empleando rastrojo de sorgo como soporte usando columnas de fermentación, un reactor de charolas y un reactor agitado por listones helicoidales. Los mejores valores de las variables principales del cultivo: fase de retardo, ųCO2, X, YX/S y rendimientos de actividades enzimáticas de lactasa e inulinasa, se obtuvieron cuando el cultivo se llevó a cabo en reactor de charolas (7.5 h, 0.35 h-1 , 54±3.8 mg X/gms, 0.36±0.02, 1755±80 UI/gX y 166±25.2 UI/gX, respectivamente). Los rendimientos de actividad lactasa en cultivo en columnas y en reactor de charolas (1433±15 y 1754.7±80 UI/gX, respectivamente), aumentaron en un 25 y 53 %, respectivamente, en comparación con los obtenidos en trabajos anteriores (1148 UI/gX). Por último, con el rastrojo de sorgo fermentado se llevaron a cabo pruebas bromatológicas y de digestibilidad ruminal, encontrando que este residuo fermentado con la levadura aporta un mayor contenido proteínico (6.7±0.2 %) que puede ser un factor determinante en la propagación de bacterias ruminales y promover una mayor digestibilidad de los compuestos fibrosos, por lo que se puede emplear en mezcla con otros ingredientes de la dieta de animales rumiantes. En este trabajo se presenta evidencia experimental indicando que es posible establecer las condiciones nutricionales de cultivo para la levadura Kluyveromyces marxianus en un sistema modelo, lo cual permitió extrapolar los resultados a un sistema más cercano a la realidad. Los resultados indican el potencial que presenta el CMS en resolver problemas ambientales y contribuir parcialmente a la producción de alimentos para rumiantes.

The whey is the main byproduct in the dairy industry and it can cause environmental problems if it is not treated suitable. Between several biotechnological alternatives, the yeasts belonging to the genus Kluyveromyces can metabolize lactose as carbon source and energy for the production of biomass and enzymes of industrial interest. On the other hand, due to the characteristics of the solid state culture (SSC), it is interesting to develop a fundamental study on the growth and physiology of Kluyveromyces in this culture system. In this sense, using a SSC with polyurethane foam like support, the effect of inoculum level, the use of pH buffers, the nitrogen source and the lactose concentration and nutrients on the main variables of the SSC (lag phase, respiratory activity rate, total CO2 formed, biomass, lactose consumption, yields and enzymatic activities) using Kluyveromyces marxianus was determined.. UCDCC 351, NCYC 587, 1109, 1429, 278 CDBBL and AGUA MIEL A1 strains were studied. Preliminary studies of the SSC of K. marxianus were also carried out on sugar cane bagasse and sorghum strubble impregnated with industrial whey in a tray reactor and in a helical ribbons rotating reactor. Studies were carried out to determine the conditions of SSC of K. marxianus CDBBL 278 using polyurethane foam impregnated with culture medium containing lactose. The monitoring of different growth phases was carried out by respirometry. An inoculation level of 2.5x106 cells per gram of dry matter (gdm) was selected for further studies. SSC cultures using two buffers: sodium acetate and potassium phosphate showed no significant difference in the final pH of the culture. Nevertheless, a significant difference (ð<0.5) in the biomass production (53±0.1 mg/gdm), cellular yield (0.36±0.01) and lactose consumption (90%) was observed when a phosphate buffer was used and for this reason phosphate buffer was selected for further studies. The addition of ammonium sulfate and urea mixtures didn’t avoid changes in the pH of the cultures; nevertheless, low urea concentrations (20% of the NT) favored the enzymatic activity of lactase as well as inulinase for all the studied strains (UCDCC 351, NCYC 587, NCYC 1109, NCYC 1149, 278 CDBBL and Agua Miel A1). NCYC 587 and CDBBL 278 strains presented the higher titles of lactase and inulinase activity, respectively, when 20 % of the nitrogen source was provided by urea (2038.3 and 241.6 IU/gX, respectively). This condition was selected to study the effect of the increase in the lactose concentration as well as of all the nutrients in SSC of K. marxianus. The maximum production of biomass for NCYC 587 and CDBBL 278 strains (71.7±5.1 and 95.8±5.1 mg/gdm, respectively) was obtained at a lactose concentration of 150 g/L. The greater rate of respiratory activity (0.3±0.003 and 0.4±0.001 h-1 , respectively), as well as the higher lactose consumption and biomass production (91.4± 0.3% and 0.36±0.01 mg/gdm, respectively) were obtained with 50 g/L lactose. Fresh whey was used as substrate in SSC of K. marxianus NCYC 587 and CDBBL 278, with an almost total lactose consumption (99±1.2 and 98±1.1%, respectively) and similar yields to those reported in the literature for these strains (0.32±0.06 and 0.33±0.03, respectively) in submerged cultures. Kluyveromyces marxianus NCYC 587 and CDBBL 278 strains were able to grow on sugar cane bagasse and sorghum strubble as natural supports using industrial whey. In the case of CDBBL 278 SSC were carried using sorghum strubble like support using 3 fermentations systems: a small columns reactor, a tray reactor and a helical ribbons rotating reactor. The best values of the main variables of the culture: lag phase, ųCO2, X, YX/S and lactase and inulinase activities, were obtained when the culture was carried out in the tray reactor (7.5 h, 0.35 h-1 , 54±3.8 mgX/gdm, 0.36±0.02, 1755±80 IU/gX and 166±25.2 IU/gX, respectively). The lactase activity yields in columns and tray reactor (1433±15 and 1754.7±80 IU/gX, respectively), increased in 25 and 53%, respectively, in comparison with the obtained in previous work (1148 IU/gX). In the case of the sorghum strubble fermented material, bromatologicals and ruminal digestibility assays were carried out, finding that the protein content was increased to 6.7± 0.2%, this fact can be an important factor in the growth of ruminal bacteria and for promoting a greater digestibility of fiber compounds for that reason it can be used in mixture with other ingredients of the ruminant feed. In this work experimental evidence appears indicating that is possible to set the nutritionals conditions of culture for the Kluyveromyces marxianus yeast in a SSC system model, it allowed extrapolation of the results to a real system. The results indicate the potential that represents the SSC in solving environmental problems and contributing partially to the feed production for ruminants.

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