Identificación y caracterización de proteasas del pepino de mar - Hernández Sámano, Arisaí del Carmen (Universidad Autónoma Metropolitana, 2010)
Holothurians, commonly known as sea cucumbers, belong to the Phylum echinoderms. These marine organisms contain a wide variety of active ingredients, such as carbohydrates, lipids, neurotoxins and enzymes. The knowledge of digestive enzymes in the sea cucumber could clarify its nutritional biochemistry and physiology. Determining the digestive capabilities of these animals would allow efficient selection of ingredients for diet formulation aimed for production. Moreover, the activity of extracted proteases from marine organisms is very high and have particular characteristics that can be efficiently exploited. In addition, sea cucumbers are illegally exploited in Mexico, the profit is generally for other countries. Therefore it is important to contribute to basic research of this resource. The objective of this study was to identify and characterize the proteases present in several organs of the sea cucumbers Holothuria impatiens and Isostichopus fuscus and to relate these active compounds to their histology. Specimens of sea cucumber (H. impatiens and I. fuscus) from the Sea of Cortés, off the coast of Sonora, collected by the Research Center for Food and Development (CIAD) were studied. They were measured, weighted and cut along the anteroposterior axis. The following regions were considered for analysis: podia or tentacles (covering the oral region), digestive tract, respiratory tract and different skin regions. For histology studies, samples of selected anatomical parts or organs were fixed with 70 % alcohol, dehydrated and embedded in paraffin; 7 to 12 μm thick sections were stained with hematoxylin-eosin, and observed under a light microscope. For enzyme characterization, we determined the endogenous proteolytic activity. Proteases were classified according to the pH of acidic and basic activity by the methods of Anson and Kunitz, respectively. Enzymatic extracts were obtained from each anatomical part or organ with a ratio of 1:2 (tissue: phosphate buffer) 20 mM pH 7, under non-denaturing conditions. The substrates, hemoglobin (pH 2-5) and casein (pH 6-10), were handled separately to 1 % and 4 ºC. The enzymatic reaction was carried out for 10 minutes at 37 °C by stopping with 50 % trichloroacetic acid, and finally, spectrophotometric readings were obtained at 280 nm. It was later determined the protein concentration by the biuret method. We estimated the molecular weights of the protease enzymatic extracts obtained by denaturing and nondenaturing electrophoresis according to the method of Laemmli (1970). We used a separation gel 12 % acrylamide gel and acrylamide concentration of 4 %. The results showed that the organs and anatomical parts of I. fuscus and H. impatiens have large amounts of tissue and cell aggregates with digestive activity, and a type of inclusions that suggest defense action of hemocytes against outside the body. Also, that may exist within these parasitic organisms and residual algae used as food. In particular, tissues that have an obvious number of cells with digestive activity in the histological study, it was the podiums or tentacles, internal tubules, breathing tube and the dorsal skin. The results obtained in enzymology studies complemented the histological study. They showed that, in general, the bodies of sea cucumbers with lower activity at acidic pH compared with the activity at basic pH. In analyzing the results of activity of different organs within species, we found that proteolytic activity was higher in the podiums were statistically significant at pH 6 to 10 (up to 81 + 3 UAP/mg for H. impatiens), suggesting the presence of serine proteases and pH 2 (up to 27 + 14 UAP/mg for H. impatiens) the presence of aspartic proteases. Also, it was observed that outer skin extracts (pH 2-4 and 10) (up to 68 + 36 UAP/mg) and the ventral skin (pH 10) (61 + 35 UAP/mg) of I. fuscus, and ventral skin extracts of H. impatiens (pH 4 and 7) have significantly higher activity than other organs, possibly by contact with the skin is the environment. It also suggests that the metabolic differences between type of family (Holothuriidae or Stichopodidae) of sea cucumbers influences the proteolytic activity. We found high molecular weight proteins, between 30 and 120 kDa, in most organs of the two species studied. In general, most of the organs of sea cucumber I. fuscus had estimated molecular weight proteins of 39 kDa, whereas in H. Impatiens proteins were between 45 and 66 kDa. The tentacles were identified in proteins of approximately 39, 45, 66 and 103 kDa, determined for I. fuscus a high concentration of protein higher than 5.5 mg/mL. In H. impatiens were identified in proteins of approximately 84.64 y 56.87 kDa. Therefore, relating the results of histology and Enzymology about the presence of certain inclusions with digestive activity, it is suggested that these hemocytes in conducting defense methods have proteolysis action acidic or basic, hence the presence of digestive activity in all anatomical parts or organs of sea cucumber. In addition to suggesting a alternate mechanism of digestion for these organisms. Thus, knowledge of digestive enzymes could clarify the nutritional biochemistry and physiology of sea cucumbers, helping to determine their digestive capacity. As evidence of the sui generis characteristics of proteases present in these species and their relation to certain tissues contribute to basic knowledge of the activity and function of these enzymes, hoping to lay the groundwork for future structural studies and potential biochemical applications.; Los holoturoideos, conocidos como pepinos de mar, pertenecen al Phylum de los equinodermos. Estos organismos marinos poseen un gran número de principios activos tales como carbohidratos, lípidos, neurotoxinas y enzimas. El conocimiento de las enzimas digestivas del pepino de mar podría aclarar su bioquímica nutricional y su fisiología. En la producción de estos organismos, determinar sus capacidades digestivas permitiría la selección eficiente de ingredientes para la formulación de dietas, establecer los plazos máximos de almacenamiento. Además, la actividad de las proteasas extraídas de organismos marinos es considerablemente alta, además que estos compuestos poseen características particulares que pueden ser aprovechadas eficientemente en varias industrias. Por otra parte, este organismo es explotado ilegalmente en México y los beneficios económicos no permanecen en el país, por lo cual es importante contribuir con las investigaciones básicas de este recurso. El objetivo de esta tesis fue identificar y caracterizar las proteasas presentes en algunos órganos de los pepinos de mar Isostichopus fuscus y Holothuria impatiens y correlacionarlos con su histología. Se utilizaron ejemplares de pepino de mar procedentes del mar de Cortés, en las costas de Sonora, recolectados por el Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CIAD). Éstos fueron medidos y posteriormente cortados a lo largo del eje antero-posterior, considerando para el análisis los podios que recubren la región oral o tentáculos, el tracto digestivo, árbol respiratorio y diferentes regiones de piel. En la caracterización histológica, las muestras de las partes anatómicas u órganos seleccionados fueron fijadas en alcohol al 70%, posteriormente se deshidrataron e incluyeron en parafina; se realizaron cortes de 7 a 12 µm de grosor, mismos que fueron teñidos con hematoxilina-eosina y finalmente se observaron en un microscopio óptico. En cuanto a la caracterización enzimática, se determinó la actividad proteolítica endógena. Se clasificaron las proteasas de acuerdo al pH de actividad en ácidas y básicas por los métodos de Anson y Kunitz, respectivamente. Se obtuvieron los extractos enzimáticos de cada parte anatómica u órgano con una relación de 1:2 (tejido: amortiguador de fosfatos) 20 mM pH 7, bajo condiciones no desnaturalizantes. Los sustratos, hemoglobina (pH 2-5) y caseína (pH 6-10), se manipularon por separado al 1 % y a 4 ºC. La reacción enzimática se llevó a cabo durante 10 minutos a 37 ºC deteniéndola con ácido tricloroacético al 50 %; finalmente, se obtuvieron lecturas espectrofotométricas a 280 nm. Posteriormente se determinó la concentración de proteína por el método de biuret. Se estimaron los pesos moleculares de las proteasas de los extractos enzimáticos obtenidos por medio de electroforesis desnaturalizante y no desnaturalizante de acuerdo al método de Laemmli (1970). Se utilizó un gel de separación de acrilamida al 12 % y un gel de concentración de acrilamida al 4%. Los resultados mostraron que los órganos y partes anatómicas de I. fuscus y H. impatiens tienen gran cantidad de tejido conjuntivo y agregados de células con actividad digestiva, además de un tipo de inclusiones que sugieren la acción de defensa de hemocitos contra agentes externos al organismo. También, demostraron que pueden existir dentro de estos organismos parásitos y residuos de algas usadas como alimento. En particular, los tejidos que presentaron una evidente cantidad de células con actividad digestiva, en el estudio histológico, fueron los podios o tentáculos, túbulos internos, tubo respiratorio y la piel dorsal. El estudio enzimológico complementó los resultados histológicos, mostrando que en general, los órganos de los pepinos de mar tuvieron menor actividad enzimática a pH ácido comparada con la actividad a pH básico. Al analizar los resultados de actividad de los diferentes órganos dentro de cada especie, se encontró que la actividad proteolítica en los podios fue mayor, siendo estadísticamente significativa a pH de 6 a 10 (hasta 81 + 3 UAP/mg para H. impatiens), sugiriendo la presencia de serín proteasas y a pH 2 (hasta 27 + 14 UAP/mg para H. impatiens) la presencia de proteasas aspárticas. Así mismo, se observó que los extractos de piel externa (pH 2-4 y 10) (hasta 68 + 36 UAP/mg) y ventral (pH 10) (61 + 35 UAP/mg) de I. fuscus, así como los extractos de piel ventral de H. impatiens (pH 4 y 7), tienen actividades significativamente mayores que otros órganos, posiblemente por el contacto que la piel tiene con el medio ambiente. Además, sugiere que las diferencias metabólicas entre el tipo de familia (Stichopodidae o Holothuriidae) de los pepinos de mar influye en la actividad proteolítica. Se encontraron proteínas de alto peso molecular, entre 30 a 120 kDa, en la mayoría de los órganos estudiados de las dos especies. En general, en la mayoría de los órganos del pepino de mar I. fuscus tuvieron proteínas de peso molecular estimado de 39 kDa, mientras que en H. impatiens las proteínas fueron de 45 a 66 kDa. En los tentáculos se identificaron proteínas de aproximadamente 39, 45, 66 y 103 kDa, determinándose para I. fuscus una alta concentración de proteína mayor a 5.5 mg/mL. En el extracto enzimático de los podios de H. impatiens se encontraron proteínas de peso molecular mayor a las de I. fuscus, su peso estimado fue de 84.64 y 56.87 kDa. Por lo tanto, relacionando los resultados del estudio histológico y enzimológico con respecto a la presencia de ciertas inclusiones con actividad digestiva, se sugiere que estos posibles hemocitos al llevar a cabo los métodos de defensa que los caracterizan tienen acción de proteólisis ácida ó básica contra agentes extraños, de ahí la presencia de actividad digestiva en todas las partes anatómicas u órganos del pepino de mar. Además de que se sugiere un mecanismo de digestión alterna para estos organismos. De tal forma, el conocimiento de las enzimas digestivas podría aclarar la bioquímica nutricional y la fisiología de los pepinos de mar, ayudando a determinar sus capacidades digestivas. Por lo que demostrar las características sui generis de las proteasas presentes en estas especies y su relación con determinados tejidos contribuirá al conocimiento básico de la actividad y función de estas enzimas, esperando sentar las bases para posteriores estudios estructurales y posibles aplicaciones bioquímicas.