Efecto de biopéptidos antioxidantes de la albúmina 1 del grano de amaranto en el estrés oxidativo ex vivo para piel humana - Ortíz Hernández, Adriana (Universidad Autónoma Metropolitana, 2013)
The skin is the largest organs of the human anatomy; it can measure and weigh up to 170- 200 cm2 and 15-17 kg, respectively. Its mail function is to protect the internal organs against noxious stimuli caused by exogenous oxidant agents. Each layer of the skin (epidermis, dermis, and hypodermis) has specific functions that regulate the adverse effects caused by free radicals. These effects are known as cutaneous aging, defined as: “accumulation of damaging molecules along time.” During this process, there is a deterioration of the skin’s biological functions that is reflected by a lower adaptation capacity to metabolic stress, becoming thinner, pale, redundant and wrinkled. It is known that excessive exposure of the skin to UV radiation accelerates the aging process causing inflammation, oxidative stress, DNA and RNA damage, among many other deficiencies that start as alterations of the skin, such as: premature wrinkles, desquamation, dryness, hypopigmentation, hyperpigmentation, and even diverse types of skin cancer. Besides the aforementioned, there is oxidation of lipids, where the non-saturated fatty acids present in phospholipids of cell membranes are attacked by free radicals forming hydroperoxides. Lipoperoxidation reactions are favored by the presence of promoting agents such as metal Cu and Fe ions (Fenton reaction), UV radiations, among others. To counteract the noxious effects of reactive oxygen species (ROS), antioxidants are used, that can be classified as exogenous (provided by the diet) and endogenous (present in the organism). Industries have dedicated great effort to the development of products to help prevent the actions of free radicals on human skin, which has led in the last years to an increase in nutricosmetic products characterized by being orally consumed that, besides providing benefits to skin´s health, complement the nutrition of the person ingesting them. Based on the aforementioned, the present thesis was aimed at evaluating the protective effects of albumin 1 and its hydrolyzates against the oxidative stress produced on the human skin by prolonged exposure to UV radiation. Proteins were extracted from defatted flour of the amaranth grain with Na₂SO₄ (5%) and precipitated (NH₄)₂SO₄. Albumin 1 was obtained by water dialysis, and was hydrolyzed with alcalasa (2.4 mUA/mL) at 24, 36, and 48 h in phosphate buffered solution (0.5 M, pH 7.4, 50ºC). Hydrolyzates were characterized according to their relative molecular weight and contents of peptide species, using SDS-PAGE and Tris-tricine-SDS-PAGE, as well as gel filtration chromatography (Sephadex G-15, G-50 and G-200). Evaluation of the protecting effects against oxidative stress in the skin was performed by means of skin biopsies (n=6, healthy women, 25-35-year-old) that were distributed in four treating groups for each sample to be tested (native albumin 1 and its hydrolyzates of 24, 26, and 48 h) in the presence of DMEM medium, with a concentration of 100 µg/mL of albumin 1 samples and their respective hydrolyzates. Groups were: skin not exposed to UV radiation (negative control, C), skin not exposed to UV radiation plus the treatment sample (G1), skin exposed to UV radiation (positive control, G2), and skin exposed to UV radiation plus the treatment sample (G3). The treatment groups were incubated during 72 h (controlled humidity, 5% CO2, 37 °C). At the end of this time, skin samples were placed in Trypsin-EDTA solution (0.025% bobine trypsin and 0.01% EDTA) to be homogenized (37°C, 4 days) and the enzymatic activities of catalase, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase were determined, as well as the concentration of malondialdehyde (MDA). Results revealed that the distribution of the hydrological species, classified according to their relative molecular weight, present in the 24 -, 36, 48-h-hydrolyzates is very varied, pointing out the presence of a higher percentage of ˂5 kDa species. Measurement of the protective effects of albumin 1 and its hydrolyzates revealed that the antioxidant enzymatic activities of superoxide dismutase, catalase, and glutathione peroxidase is kept significantly for each of the assayed samples, without showing significant differences (p˂0.05) among them. Measurement of the concentration of malondialdehyde (indicator of lipoperoxidation) present in the skin cultures for each treatment group revealed a very clear effect in the diminution of MDA, indicating that both albumin 1 and its hydrolyzates inhibited significantly (p˂0.05) the lipoperoxidation process that occurs in the skin due to prolonged exposure to UV radiation. Based on the aforementioned results we propose albumin 1 from the amaranth grain and its hydrolyzates with antioxidant activity as an active component that can be used in the formulations of nutricosmetics with protecting effects on the activity of antioxidant enzymes and inhibition of lipoperoxidation, as well as a good source of essential amino acids. At the same time, we propose to stimulate the cultivation of this grain, which has decreased in the last years.; La piel es uno de los órganos más grandes de la anatomía humana, llega a medir y pesar 170-200 cm2 y 15-17 kg, respectivamente. Tiene como función principal proteger los órganos internos del cuerpo contra los efectos nocivos provocados por agentes oxidantes exógenos. Cada capa que la compone (epidermis, dermis e hipodermis) tiene funciones especificas, que regulan los efectos adversos causados por los radicales libres. A estos efectos se les conoce como envejecimiento cutáneo, definido como “acumulación de moléculas dañinas a través del tiempo”. Durante este proceso se produce un deterioro de funciones biológicas propias de la piel, lo que se traduce en una menor capacidad de adaptación al estrés metabólico, tornándose más fina, pálida, redundante y con arrugas. Se sabe que la exposición excesiva de la piel a la radiación UV solar acelera el proceso de envejecimiento, causando inflamación, estrés oxidativo y daños en ADN y ARN, entre muchas otras deficiencias que inician trastornos en la piel, como arrugas prematuras, descamación, sequedad, hipopigmentación, hiperpigmentación e incluso diferentes tipos de cáncer de piel. Aunado a lo anterior, se da la oxidación de lípidos, por la que los ácidos grasos no saturados presentes en los fosfolípidos de las membranas celulares son atacados por radicales libres, formando hidroperóxidos. Las reacciones de lipoperoxidación se favorecen por la presencia de agentes promotores, como los iones metálicos Cu y Fe (reacción de Fenton) y luz UV, entre otros. Para contrarrestar los efectos dañinos de las especies reactivas de oxígeno se utilizan antioxidantes, que pueden ser clasificados en exógenos (suministrados por la dieta) y endógenos (presentes en el organismo). La industria se ha dado a la tarea de desarrollar productos que ayuden a prevenir la acción de los radicales libres en la piel humana, por lo que en los últimos años se ha observado un aumento en el desarrollo de productos nutricosméticos, cuya característica principal es ser productos de consumo oral que, además de proporcionar beneficios a la salud de la piel, complementan la nutrición de la persona que los consume. Debido a lo anterior, en la presente tesis se propuso evaluar los efectos protectores de la albúmina 1 y sus hidrolizados contra el estrés oxidativo de la piel humana inducido por la exposición prolongada a rayos UV. Partiendo de harina desengrasada del grano de amaranto, la extracción de proteínas se realizó con Na₂SO₄ (5%) y precipitación con (NH₄)₂SO₄. La albúmina 1 fue obtenida por diálisis en agua, y posteriormente hidrolizada con alcalasa (2.4 mUA/mL) en tiempos de 24, 36 y 48 h, en solución de búfer de fosfatos (0.5 M, pH 7.4, 50ºC). Los hidrolizados se caracterizaron de acuerdo a su peso molecular relativo y al contenido de especies peptídicas, utilizando SDS-PAGE y Tris-tricina-SDS-PAGE, así como cromatografía de filtración en gel (Sephadex G-15, G-50 y G-200). La evaluación de efectos protectores contra el estrés oxidativo en piel se realizó en biopsias de piel (n=6, mujeres saludables, 25-35 años) que fueron distribuidas en cuatro grupos de tratamiento para cada muestra a probar (albúmina nativa e hidrolizados de 24, 26, y 48 h) en presencia de medio DMEM, con una concentración de muestras de albúmina 1 y sus respectivos hidrolizados de 100 µg/mL. Los grupos fueron: piel no expuesta a radiación UV (control negativo, C), piel no expuesta a radiación UV más la muestra de tratamiento (G1), piel expuesta a radiación UV (control positivo, G2) y piel expuesta a radiación UV más la muestra de tratamiento (G3). Los diferentes grupos de tratamiento fueron incubados durante 72 h (humedad controlada, 5% CO2, 37°C). Al termino de este tiempo, las muestras de piel fueron colocadas en solución Tripsina-EDTA (0.025% de tripsina bovina y 0.01% de EDTA) para ser homogenizadas (37°C, 4 días) y se determinó la actividad enzimática de la catalasa, superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa, así como la concentración de malondialdehído. En los resultados obtenidos se observó que la distribución de especies hidrológicas de la albúmina 1 (clasificadas de acuerdo a su peso molecular relativo) presentes en los hidrolizados de 24, 36 y 48 h es variada, destacando la presencia de un mayor porcentaje de especies peptídicas ˂5 kDa. Al medir los efectos protectores de la albúmina 1 y sus hidrolizados se observó que la actividad enzimática antioxidante de superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa se mantiene de forma significativa en presencia de cada muestra ensayada, sin mostrar diferencias significativas (p˂0.05) en los efectos protectores entre cada una de ellas. Al medir la concentración de malondialdehído (indicador de lipoperoxidación) presente en los cultivos de piel para cada grupo de tratamiento, se observó una disminución muy clara de la misma, lo que indica que tanto la albúmina 1 como sus hidrolizados inhiben de forma significativa (p˂0.05) el proceso de lipoperoxidación que se lleva a cabo en la piel tras la exposición prolongada a la radiación UV. De acuerdo con todo lo anterior, se propone a la albúmina 1 del grano de amaranto y sus hidrolizados con actividad antioxidante como principio activo, pudiendo ser utilizados en la formulación de nutricosméticos con efectos protectores en la actividad de enzimas antioxidantes e inhibición de lipoperoxidación (además de constituir una buena fuente de aminoácidos esenciales). Estos resultados podrían servir, además, para incentivar el cultivo de este grano, que ha disminuido en los últimos años.