Inducción de compuestos con actividad antiinflamatoria en cultivos de células en suspensión de Sphaeralcea angustifolia (Cav.) G. Don (Malvaceae) a nivel de matraces y en biorreactor Público Deposited

La inflamación es un proceso fisiopatológico asociado a un gran número de padecimientos crónico degenerativos, principalmente reumáticos, cardiovasculares, gástricos y neurológicos. Las enfermedades reumáticas son uno de los principales problemas de salud en el mundo; en México, las personas en edad productiva laboral son las más afectadas por estas enfermedades. Por lo anterior, es un tema prioritario de salud y de importancia económica que motiva a la búsqueda de nuevos agentes antiinflamatorios que actúen sobre los blancos terapéuticos de interés. Las plantas medicinales son una gran fuente de compuestos que poseen una diversidad estructural química con potencial biológico, por lo que pueden ser utilizadas como medicamentos o como base para su producción. Un número importante de especies vegetales han sido utilizadas tradicionalmente para el tratamiento de pacientes con enfermedades que conllevan un proceso inflamatorio, dentro de estas se destaca Sphaeralcea angustifolia. Esta especie cuenta con el respaldo farmacológico que sustenta el uso tradicional, así como la evaluación clínica en pacientes con osteoartritis de un fitomedicamento estandarizado en el contenido del antiinflamatorio escopoletina. No obstante, los estudios químicos de la especie son escasos, por lo que es importante el identificar y caracterizar a otros compuestos que coadyuven al efecto antiinflamatorio de S. angustifolia. Considerando que la planta crece en poblaciones aisladas y su colecta está controlada por la SEMARNAT (NOM-007-RECNAT-1997) fue indispensable búscar alternativas para la obtención de tejido vegetal y conservación de la especie. Para tal propósito, se desarrollaron cultivos de callos morfogenéticos a través de los cuales se logró la micropropagación indirecta de la planta. Asimismo, se establecieron cultivos de células en suspensión productores del compuesto activo escopoletina. Este sistema se empleó para evaluar una estrategia de estimulación modificando el balance carbono:nitrógeno, al reducir el contenido de nitrato en el medio de Murashige y Skoog (MS) a 2.74 mM; condición que no afectó el crecimiento de la suspensión celular, favoreció la producción de la escopoletina y estimuló la producción de otros dos compuestos del tipo fenólico.

En el modelo DPA el crecimiento de los cultivos celulares se redujo en un 74% en los cultivos desarrollados con mayores contenidos de ambos nutrientes. Asimismo, se determinó que contenidos por arriba de 5.68 μM de cobre en el medio MS inhiben el crecimiento en la suspensión celular, provocando lisis y muerte celular. La producción de cumarinas y el ácido sphaerálcico, generó un punto de inflexión de la curva y para encontrar las condiciones óptimas se evaluó el efecto del nitrato y cobre en intervalos de concentración cortos. Para completar el modelo cuadrático (Diseño Compuesto Central, DCC) y encontrar las condiciones de nitrato y de cobre óptimas, fue necesario añadir al DF cuatro puntos más (Diseño en Estrella, DE) tomando como punto de origen las condiciones nutricionales de 2.74 mM de nitratos y 2 µM de cobre. En el modelo DCC se determinó que la modificación en la concentración de nitrato y cobre en el medio de cultivo MS moduló favorablemente la producción de tomentina, escopoletina y ácido sphaerálcico en los cultivos de células en suspensión de S. angustifolia. La interacción de 2.42 mM de nitratos y 1.81 μM de cobre estimula la mayor producción de las cumarinas, registrando niveles de 236.45 µg/L en biomasas y de 4,136. 96 μg/L en el medio a los 2 días de cultivo. No se determinó interacción de los factores sobre producción de ácido sphaerálcico, prediciendo que las mejores condiciones para su excreción se obtuvieron con 0.32 mM de nitratos libre de cobre a los 4 días (5,258.12 μg/L) de cultivo; mientras que su acumulación (756.91 μg/L) se favoreció con la presencia de 2.26 μM de cobre y 0.32 mM de nitrato. La producción de las cumarinas en respuesta al estímulo es similar a la de una fitoalexína, en cambio, la producción del ácido sphaerálcico es característica de un metabolito secundario constitutivo. A continuación, se evaluó si los compuestos antiinflamatorios obtenidos en la suspensión de S. angustifolia a nivel de matraces, se producen en el cultivo celular desarrollado en biorreactor de laboratorio con agitación mecánica. Las suspensiones produjeron escopoletina y tomentina con una tendencia similar a lo registrado a nivel de matraz; en cambio, las máximas producciones de ácido sphaerálcico se observaron a los 2 y 4 días de cultivo. En estos casos, con respecto a la producción registrada a nivel de matraz, la acumulación fue 20.2 y 78.1 veces mayor, y su excreción fue 6.5 y 16.9 veces superior, respectivamente.

En este proyecto inicialmente se planteó aislar e identificar la estructura de los dos compuestos producidos en la suspensión celular de S. angustifolia cultivada en medio MS con restricción de nitrato, así como evaluar su efecto sobre la formación de los edemas plantar inducido con λ-carragenina y auricular con TPA (12-otetradecanoilforbol-13-acetato). Los datos espectroscópicos de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) permitieron identificar estructuralmente a la tomentina (5-hidroxi-6,7- dimetoxicumarina) y al ácido 2-(1,8-dihidroxi-4-isopropil-6-metil-7-metoxi) naftoico, el cual se aisló e identificó por primera vez en cultivos de células en suspensión de una especie del género Sphaeralcea, denominándolo como ácido sphaerálcico. Ambos compuestos inhibieron el desarrollo del edema subplantar, actividad que fue similar a la del fármaco indometacina. En el modelo de edema auricular la actividad antiinflamatoria de la tomentina fue similar a la de los fármacos sintéticos (indometacina y naproxeno); en tanto que la del ácido sphaerálcico (DE50 de 0.54 mg/oreja) fue significativamente superior a el efecto mostrado por la tomentina y el fármaco naproxeno. Posteriormente, este estudio se enfocó en optimizar la producción de los compuestos activos (escopoletina, tomentina y ácido sphaerálcido) producidos en las suspensiones celulares de S. angustifolia, sin dejar de tomar en cuenta el comportamiento del crecimiento celular, siendo este uno de los factores asociado a la producción. Así, se planteó establecer los niveles óptimos de nitrato y de cobre, el cual simula el ataque de un microorganismo patógeno, empleando la metodología de superficie de respuesta (MSR) como modelo. En la etapa de Diseño Factorial (DF) se determinó que los niveles de nitrato y cobre en el medio MS no modificaron la velocidad de crecimiento (0.317-0.389 días-1 ) ni el tiempo de duplicación (1.78-2.18 días) de la suspensión celular de S. angustifolia; no obstante, la mayor biomasa celular (14.62 g/L) se obtuvo al incrementarse el contenido de nitrato (2.74 mM) y disminuyendo el del cobre (0.1 μM). La mayor producción de cumarinas y ácido sphaerálcico se observó a los 2 y 4 días de cultivo, favorecidos por la interacción de los contenidos de nitrato y cobre, los valores de 2.74 mM de nitratos y 2 μM de cobre fueron utilizados como base para el establecimiento del Diseño de Paso Ascendente (DPA).

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  • 2014
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Última modificación: 09/27/2022
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