Determinación del daño oxidativo generado por el metabolismo de etanol en líneas celulares hepáticas Público Deposited

The hepatic diseases occupy the fifth cause of death in our country, and a 50% are due to the chronic ethanol intake (EtOH) being a problem of public health. The EtOH is oxidized by different enzymatic systems, the alcohol dehydrogenase (ADH), cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) and catalase, this last one contributes just by 2%.The EtOH-induced liver damage is driven mainly by alcohol metabolites such as acetaldehyde and reactive oxygen species (ROS). The ROS generates oxidation on lipids, proteins and DNA, inducing cellular dysfunction and eventually cell death which lead organ failure. Studies on primary hepatocytes are limited by an accelerated loss of Cyp2E1 and ADH activities so, stable cells lines transfected with these enzymes are required to understand the mechanism of alcohol-induced liver damage. The aim of this study was to address the differences in the oxidative damage due two cells lines, recombinant HepG2 cells, to overexpressing of ADH gene (VA-13), another which express ADH and Cyp2E1 genes (VL-17A cells). METHODS: Quantification of the cellular viability by the MTT assay, peroxides quantification was performed by DCF fluorescent-FACS flow, superoxide dismutase (SOD) activity, glutathione levels and lipid peroxidation (LPO) product (malondialdehyde, MDA) were measured spectrophotometrically. Results: The cells were exposed to different concentrations from EtOH (50-500 mM) by 24 h, finding that to 50-100 mM of EtOH the three cellular types displayed viability from the 87-97% with respect to the control. To greater concentrations of EtOH the viability decreased drastically until a 60%. The next experiments of the cells were treated with 100 mM EtOH during 24 h, Only VL-17A cells responded to EtOH treatment increasing production of peroxides and 4-fold more of MDA, this result was correlated with a decrease in mitochondrial GSH (50%) and SOD activity (20%). Conclusion: Our data have revealed that Cyp2E1 is required for ethanol-induced damage. Therefore, the accumulation of CYP2E1 induced by ethanol consumption might play important role in alcohol liver damage.

Las enfermedades hepáticas ocupan la quinta causa de muerte en nuestro país y un 50% es debido a la ingesta crónica de etanol (EtOH) siendo un problema de salud pública, por lo que es importante conocer el daño producido por el metabolismo de etanol (EtOH). Este daño está asociado en parte a un incremento de las especies reactivas de oxígeno (ERO) y/o una disminución de los mecanismos celulares de defensa antioxidantes dando como resultado estrés oxidativo. Las ERO pueden interactuar con las proteínas, los lípidos y el ADN causando daño celular que puede incluso ocasionar la muerte celular. El EtOH es oxidado por distintos sistemas enzimáticos, la alcohol deshidrogenasa (ADH), el citocromo P450 (CYP2E1) y la catalasa, este último contribuye con solo el 2%. En todos los casos se produce acetaldehído, producto más tóxico que el propio EtOH. Estudios in vitro del metabolismo de EtOH han presentado problemas para su realización, ya que los cultivos primarios de hepatocitos pierden en poco tiempo la capacidad de oxidar el EtOH, y líneas celulares hepáticas como la HepG2 carecen de dicha actividad. Por ello varios grupos de investigación han desarrollado sistemas in vitro con la capacidad de oxidar el EtOH. En el presente trabajo se utilizaron células HepG2 transfectadas con el gen de la ADH y del CYP2E1 (VL-17A) o bien sólo con el gen de la ADH (VA-13), con la finalidad de comparar el daño oxidativo producido por el metabolismo del EtOH en las líneas celulares hepáticas. METODOLOGÍA: Cuantificación de la viabilidad celular por el método de MTT. La producción de las ERO en las células se determinó por la fluorescencia de diclorofluoresceína (DCF) en presencia de peróxidos. El grado lipoperoxidación (LPO) se cuantificó mediante la formación de malondialdehído (MDA). La actividad de la superóxido dismutasa (SOD) y el contenido del glutatión reducido (GSH) celular y mitocondrial determinados por métodos espectrofotométricos. RESULTADOS: Las células fueron expuestas a diferentes concentraciones de EtOH (50-500 mM) por 24 h, encontrando que a 50 y 100 mM de EtOH, los tres tipos celulares presentaron una viabilidad del 87 al 97% con respecto al control. A concentraciones mayores de EtOH la viabilidad disminuyó drásticamente hasta un 60%. Se eligió la concentración de 100 mM EtOH para los siguientes experimentos. Las células VA-13 y HepG2 no presentaron cambios en la producción de peróxidos, mientras las células VL-17A tratadas con EtOH mostraron un aumento de 2 veces en la formación de peróxidos. Las células VA-13 y HepG2 no presentaron un incremento en el daño lipoperoxidativo. Sin embargo, las células VL-17A presentaron 4 veces más, este parámetro y disminuyo la actividad de la SOD un 20%, mientras los otros tipos celulares no mostraron diferencias. El contenido de GSH celular no tuvo cambio en los tres tipos celulares, en contraste el contenido de GSH mitocondrial disminuyó en un 50% en las células VL-17A. CONCLUSIÓN: Los resultados muestran que cuando el EtOH es metabolizado por el sistema CYP2E1 se generan las ERO, ocasionando daño celular por el estrés oxidativo, lo cual no sucede cuando la oxidación es por la enzima ADH, lo cual explica, en parte, el daño generado durante la ingesta crónica de etanol.

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