Regulación y producción de las EROs durante la FS y FL de lovastatina por Aspergillus terreus - Pérez Sánchez, Ailed (Universidad Autónoma Metropolitana, 2018)
In the study of FS, very interesting and high-impact attributes have been found, for example, that economic substrates can be used, little processing is required, and less power is used. The most important factor is that they have high productivities and yields that are generally higher than in FL. In addition, there are secondary metabolites that can only be produced in FS, even though the producing fungus also grows in FL. Other advantages that FS presents are the low water activity, which helps to avoid contamination and generates less effluents. The FS is also characterized by being able to use high concentrations of substrate that allows to use smaller reactors compared to those used in another type of fermentation. Because of all these advantages FS is an alternative growing method that has become increasingly attractive to research and industry. These advantages of FS are known to come from a special physiology presented by microorganisms in FS is not well characterized, although the term physiology of the solid medium has already been coined. In studies conducted by Miranda et al. 2013 was studied the generation of EROs and the oxidative state of the cell, it was surprisingly found that the accumulation of EROs coincides with the start of the production of lovastatin i.e. the EROs contribute in the signaling to initiate the idiofase of FS and FL, subsequent studies showed that ROS regulated the biosynthesis of lovastatin (Miranda et al., 2013).It is evident that the EROs play a very important role as signaling molecules and that they interact with the signal transduction pathways, in order to respond to certain environmental conditions. The results obtained in this project have clarified the role of EROs in the biosynthesis of lovastatin and how it has been advanced step by step, to understand the mechanism of the role of these molecules in secondary metabolism. Lovastatin was studied as a possible antioxidant and it was determined that lovastatin plays no role in the control of ROS in the cell. The accumulation of EROs was analyzed over time and it was observed that the EROs are signaling throughout the idiofase and that the first hours are the most important for the EROs to signal the biosynthesis of lovastatin. Using different inhibitors, the contribution of the sources of EROs during the idiofase was determined for both fermentations: from respiration originated in the mitochondria with 75-80 %, NOX 13-17 % and xanthine oxidase 2-6 %; this for both fermentations (FS and FL). We studied the accumulation of anion super oxide and hydrogen peroxide, main EROs in the cell, for the superoxide anion it was found that at the beginning of the idiofase at 24h there is an accumulation, this indicates that it could be participating in the start of the start of the idiofase and the biosynthesis of secondary metabolism. In the case of hydrogen peroxide it was found that it is accumulating throughout the idiofase. The enzyme activities of the main antioxidant defenses of the cell were studied: superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), what was observed was that in the trophophase the activity of these enzymes, both SOD and CAT, is strongly active and decreasing as the idiofase starts. This behavior appears in both fermentation systems.But no differences were found in the activity of these enzymes in the idiofase. The main studies focused on the respiration of the solid and liquid cultures, thus establishing that, in the FS of lovastatin, RA is activated precisely at the beginning of idiofase, maintaining a fairly constant activity throughout the production phase. While there was no AOX activity in the FL. On the other hand, the aox and nadh alternative gene were identified in the A. terreus genome. It was shown that the aox gene in FS is induced during idiophase, whereas in FL alternative NADH are those that are being strongly expressed in idiofase. It is proposed that in FS, the direct contact with air represents a high availability of O2, this can generate dangerous concentrations of EROs, then, the RA is activated to decrease the production of EROs in idiofase. Since no AOX activity was found in FL, but it is possible for alternative NADHs, it is possible that these alternative non-mitochondrial oxidases are the mechanism for reducing the EROs in this culture system. The silenced strain of yap1 was characterized, the main differences were the advancement and increase in the accumulation of EROs, as well as the progress and increase in the biosynthesis of lovastatin. The EROs of the parental strain were equalized with the transformant siyap1, through the use of an exogenous antioxidant, and the biosynthesis of lovastatin was also reduced to the same range of the wild strain, while siyap1 without antioxidants shows higher levels characteristic of the silencing and with an advance.Therefore, the silencing of yap1 changed the EROs and these were responsible for the increase and advancement of lovastatin biosynthesis; demonstrating that the yap1 gene is not a negative regulator of lovastatin biosynthesis. The intracellular levels of cAMP, the enzymatic activity of PKA were determined in the FS and FL systems; and glucose concentrations and ERO levels. It was found that the levels of AMPc-PKA are higher in trophophase and decrease as the idiofase starts. It was found that there is an advance in the decrease of cAMP levels in the silenced of yap1 at 21h in FL and 19h FS; this coincided with an advance in the accumulation of EROs and an advance in the decline of PKA activity, which led to an advancement of lovastatin biosynthesis. This proposes that the regulation of EROs is cascaded upstream of catabolic repression and that it is through the modification of cAMP-PKA in the biosynthesis of lovastatin by Aspergillus terreus. Ras proteins are members of a family of small monomeric GTPases that are conserved remarkably in eukaryotes. Ras serves as a signal transducer between extracellular stimuli and intracellular signaling cascades. An expression analysis of these enzymes was carried out, which was found to be very interesting, since in the case of ras1, it is shown that the expression is constitutive, although it is intensified in the idiofase. In the case of ras2, surprisingly only expression was found in the FS. This could be the key to the different physiology observed in this type of fermentation. This work helped to understand how the EROs are present in the secondary metabolism of Aspergillus terreus to be able to apply and develop fermentation systems that take advantage of the particularities of the FS, and although it is still lacking to be able to understand which stimuli are those that propitiate the high productions besides From the physiological differences that arise during the growth of microbial cells in the two types of culture systems, an important advance has been made to understand the physiology of the solid medium.; En el estudio de la FS se han encontrado atributos muy interesantes y de gran impacto como por ejemplo que se pueden utilizar sustratos económicos, se requiere poco procesamiento y se utiliza menos potencia. El factor más importante es que presentan altas productividades y rendimientos generalmente más altos que en FL. Además, existen metabolitos secundarios que sólo pueden producirse en FS, a pesar de que el hongo productor también crece en FL. Otras ventajas que presenta la FS es la baja actividad del agua, que ayuda a evitar las contaminaciones además de que genera menos efluentes. La FS se caracteriza también por poder utilizar altas concentraciones de sustrato que permite utilizar reactores más pequeños en comparación con los utilizados en otro tipo de fermentación. Debido a todas estas ventajas la FS es un método de cultivo alternativo que se ha vuelto cada vez más atractivo para la investigación y para la industria. Se sabe que estas ventajas de la FS provienen de una fisiología especial que presentan los microorganismos en FS no está bien caracterizada, aunque ya se ha acuñado el término de fisiología del medio sólido. En estudios realizados por Miranda et al. 2013,se estudió la generación de EROs y el estado oxidante de la célula, se encontró sorprendentemente que la acumulación de EROs coincide con el inicio de la producción de lovastatina es decir las EROs contribuyen en la señalización para iniciar la idiofase de FS y FL, en estudios posteriores se demostró que las EROS regulaban la biosíntesis de lovastatina (Miranda et al. 2014). Es evidente que las EROs juegan un papel muy importante como moléculas señalizadoras y que interactúan con las vías de transducción de señales, para dar una respuesta a ciertas condiciones ambientales. Los resultados obtenidos en este proyecto han aclarado la función de las EROs en la biosíntesis de lovastatina y cómo se ha avanzado paso a paso, para entender el mecanismo del papel de estas moléculas en el metabolismo secundario. Debido a que se ha planteado que varios metabolitos secundarios tienen actividad antioxidante, debido a que son producidos en respuesta al estrés oxidante, en el caso de la lovastatina, se estudió si tiene esta función y se determinó que la lovastatina no juega ningún papel en el control de las EROs dentro de la célula. Se analizó la acumulación de EROs a lo largo del tiempo y se observó que las EROs están señalizando durante toda la idiofase y que las primeras horas son las más importantes para que las EROs señalicen la biosíntesis de lovastatina. Usando diferentes inhibidores se determinó el aporte de las fuentes de EROs durante la idiofase para ambas fermentaciones: de la respiración originada en la mitocondria con un 75-80%, NOX 13-17% y la Xantina oxidasa 2-6%; esto para ambas fermentaciones (FS y FL). Se estudió la acumulación de anión súper oxido y peróxido de hidrógeno, principales EROs en la célula, para el anión superóxido se encontró que al inicio de la idiofase a las 24h hay una acumulación, esto indica que podría estar participando en el arranque del inicio de la idiofase y la biosíntesis del metabolismo secundario. En el caso del peróxido de hidrógeno se encontró que está acumulándose durante toda la idiofase. Se estudiaron las actividades enzimáticas de las principales defensas antioxidantes de la célula: la superóxido dismutasa (SOD) y la catalasa (CAT), lo que se observó fue que en la trofofase la actividad de estas enzimas, tanto de SOD como de CAT, está fuertemente activa y va decreciendo conforme inicia la idiofase. Este comportamiento aparece en ambos sistemas de fermentación. Pero no se encontraron diferencias en la actividad de estas enzimas en la idiofase. Los principales estudios se centraron en la respiración de los cultivos sólido y líquido, así se estableció que en la FS de lovastatina, la respiración alternativa (RA) se activa precisamente al comienzo de idiofase manteniendo una actividad bastante constante durante toda la fase de producción. Mientas que no se encontró actividad de la enzima mitocondrial oxidasa alternativa (AOX) en la FL. Por otro lado, se identificó el gen aox y nadh alternativa en el genoma de A. terreus. Se demostró que el gen aox en FS se induce durante la idiofase, mientras que en FL las NADH alternativas son las que se están expresando fuertemente en idiofase. Se propone que en FS, el contacto directo con el aire representa una gran disponibilidad de O2, esto puede generar concentraciones de EROs peligrosas, entonces, la RA se activa para disminuir la producción de EROs en idiofase. Dado que no se encontró actividad de AOX en FL, pero sí de las NADH alternativas es posible que estas oxidasas no mitocondriales alternativas sean el mecanismo de reducción de las EROs en este sistema de cultivo. La cepa silenciada de yap1 se caracterizó, las principales diferencias fueron el adelanto e incremento en la acumulación de EROs, así como también el adelanto e incremento en la biosíntesis de lovastatina. Se igualaron las EROs de la cepa parental con la transformante siyap1, a través del uso de un antioxidante exógeno, y la biosíntesis de lovastatina también se redujo al mismo rango de la cepa silvestre, mientras que siyap1 sin antioxidantes muestra mayores niveles característicos del silenciamiento y con un adelanto. Por lo tanto el silenciamiento de yap1 cambió las EROs y éstas fueron las responsables del aumento y adelanto de la biosíntesis de lovastatina; lo que demuestra que el gen yap1 no es un regulador negativo de la biosíntesis de lovastatina. Se determinaron en los sistemas de FS y FL los niveles intracelulares de AMPc, la actividad enzimática de las PKA; y las concentraciones de glucosa y los niveles de EROs. Se encontró que los niveles de AMPc-PKA son mayores en trofofase y van decreciendo conforme inicia la idiofase. Se encontró que en hay un adelanto en la disminución de los niveles de AMPc en la cepa silenciada de yap1 a las 21 h en FL y 19 h FS; esto coincidió con un adelanto en la acumulación de EROs y un adelanto de la baja de la actividad de PKA, lo que provocó un adelanto de la biosíntesis de lovastatina. Esto propone que la regulación de las EROs está cascada arriba de la represión catabólica y que es a través de la modificación de AMPc-PKA en la biosíntesis de lovastatina por Aspergillus terreus. Las proteínas Ras son miembros de una familia de pequeñas GTPasas monoméricas que se conserva notablemente en eucariotas. Ras sirve como un transductor de señal entre los estímulos extracelulares y las cascadas de señalización intracelular. Se realizó un análisis de expresión de estas enzimas, lo que se encontró fue muy interesante, ya que para el caso de ras1 como se muestra que la expresión es estable en trofofase y se intensifica en la idiofase. En el caso de ras2, sorprendentemente sólo se encontró expresión en la FS. Esto podría ser la clave para la diferente fisiología que se observa en este tipo de fermentación. Este trabajo ayudó a entender como las EROs están presenten en el metabolismo secundario de Aspergillus terreus para poder aplicar y desarrollar sistemas de fermentación que aprovechen las particularidades de la FS, y aunque aún falta para poder comprender qué estímulos son los que propician las altas producciones, además de las diferencias fisiológicas que surgen durante el crecimiento de células microbianas en los dos tipos de sistemas de cultivo, se ha logrado un importante avance para entender la fisiología del medio sólido.