Efecto de la seroalbúmina de leche en la actividad de la β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis Público Deposited

La aplicación de la lactasa ó β-galactosidasa en la industria de lácteos se ha intensificado en los últimos años (García-Garibay y Gómez-Ruiz, 1996; Ladero y col., 2000; Becerra y col., 2001). Existe un gran interés para la hidrólisis de la lactosa en suero ya que es un subproducto de la industria quesera y causa problemas ambientales debido a la alta demanda bioquímica de oxígeno (DBO). Desde un punto de vista general, la hidrólisis de la lactosa provee de varias ventajas nutricionales, debido a que una parte de la población sufre de deficiencia de la lactasa, lo que ocasiona problemas relacionados con la intolerancia a la lactosa. Además, ofrece ventajas tecnológicas, ya que la glucosa y galactosa, monosacáridos que forman la lactosa, son más dulces y más solubles que la lactosa, con lo cual se abaten costos por las cantidades de azúcar utilizadas. Varios reportes establecen que la presencia de algunas proteínas del suero de la leche en el medio de reacción puede aumentar la actividad de la lactasa (Mahoney y Adamchuck, 1980; Greenberg y col., 1985, Jiménez-Guzmán, 2003) pero no dan una explicación clara de tal efecto. Han sido pocos los estudios que se han llevado a cabo para tratar de explicar los mecanismos de activación de la lactasa con otras proteínas, entre ellas, las de la leche. Por tal motivo, el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la seroalbúmina de leche (BSA) en la actividad de la lactasa de Kluyveromyces lactis, así como estudiar la interacción entre la enzima y la proteína para tratar de proponer un mecanismo por el cual se dé la activación. En una primera etapa del proyecto se purificó la BSA de Sigma® por isoelectroenfoque. La pureza se comprobó por medio de electroforesis nativa y desnaturalizante. La masa molecular relativa de la BSA fue de 66.2 kDa. Posteriormente se probaron diferentes concentraciones de BSA purificada en los medios de reacción (0.1 a 10 mg/mL), la actividad de la lactasa aumentó en presencia de BSA en todas las concentraciones probadas, aún en aquellas menores a la concentración de esta proteína en la leche (0.4 mg/mL). No se encontró diferencia significativa en el efecto activador de soluciones entre las diferentes concentraciones de BSA utilizadas, sugiriendo que en las concentraciones estudiadas se da un efecto de saturación de la enzima, por parte de la BSA, probablemente a que la relación molar de BSA está en exceso con respecto a la lactasa en los medios de reacción: 1.5 mol de BSA por cada mol de lactasa. Para comprobar si hay interacción entre la BSA y la lactasa, y determinar si esta unión es específica, se utilizó la cromatografía de afinidad, inmovilizando covalentemente la BSA en una resina comercial (Eupergit®). Se logró inmovilizar 0.092 µmol BSA/g de resina, misma que interaccionó con la lactasa en una relación molar de 0.1 mol de lactasa por cada mol de BSA inmovilizada. La actividad específica en el sobrenadante disminuyó significativamente respecto al control (resina bloqueada con glicina) demostrando que hay una interacción específica entre la enzima y la proteína de leche, lo cual podría estar relacionado con el efecto activador. Más aún, se comprobó a través de electroforesis nativa en gel de poliacrilamida que hubo disminución significativa en las bandas de 145 y 100 kDa, correspondientes a las subunidades de lactasa. Se utilizaron gradientes de pH para intentar separar la lactasa de la BSA, sin embargo, con ninguno de los pHs probados (pHs 3 a 10) se logró la separación, sugiriendo que la interacción entre estas proteínas es fuerte y no depende solamente de interacciones electrostáticas. Más aún, al medir la actividad residual después de la exposición a diferentes pHs, se determinó que la presencia de la BSA tuvo un efecto estabilizador sobre la lactasa. Con la finalidad de comparar la BSA con una proteína de origen no lácteo, se probó el efecto de la ovoalbúmina (OVA) sobre la actividad de la lactasa. La OVA se probó a las mismas concentraciones usadas para la BSA, sin embargo, a diferencia de ésta, la OVA aumentó la actividad de la β-galactosidasa de manera proporcional a su concentración sugiriendo que el mecanismo de activación podría ser diferente para las dos proteínas.

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  • 2007
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Última modificación: 11/01/2022
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