Estudio de la asimetría de la membrana plasmática del espermatozoide de conejo durante la capacitación y la reacción acrosomal - Ávalos Rodríguez, Alejandro (Universidad Autónoma Metropolitana, 1998)
La capacitación puede ser definida, como una serie de cambios bioquímicos en la membrana plasmática que preparan al espermatozoide para la reacción acrosomal. (Austin, 1967; Yanagimachi, 1994). Durante la capacitación se produce una remoción o alteración gradual de glicoproteínas periféricas, una redistribución de glicoproteínas integrales, la reducción de colesterol en la membrana, y cambios en la distribución y composición de fosfolípidos (Yanagimachi, 1995). El calcio extracelular es requerido para completar la capacitación, y para realizar la reacción acrosomal, mediante una acción directa sobre la membrana plasmática y la membrana acrosomal externa permitiendo su fusión y la formación de vesículas, así como la liberación de las enzimas acrosomales (Chetham y col., 1990). La reacción acrosomal representa un requerimiento indispensable en la fertilización. A la fecha se desconocen con precisión los cambios membranales que ocurren durante la capacitación, así como aquellos que se requieren para la vesiculación en la reacción acrosomal. El propósito del presente trabajo es conocer si existe movimiento de “flip -flop” en la membrana plasmática del espermatozoide durante la capacitación y la reacción acrosomal. Además, se pretende conocer sí existen diferencias al respecto entre los espermatozoides del eyaculado y los de cola de epidídimo de conejo Nueva Zelanda, y corroborar la importancia del Ca2’ en estos procesos. Los espermatozoides se obtuvieron de eyaculados, utilizando una vagina artificial y de la cola del epidídimo por cirugía. Las muestras obtenidas, se incubaron a 37OC, en atmósfera de carbógeno en medio Brackett con y sin Caz’ y con y sin ionóforo de calcio A23187 (0.01 mM). Los espermatozoides de cada tratamiento, se incubaron con anexina V fluoresceinada con el propósito de detectar en un citómetro de flujo (FAC Sort Becton Dickinson) su unión a fosfatidilserina y con esto detectar cambios en la asimetría de la membrana. Los resultados cuando los espermatozoides fueron obtenidos de la cola del epidídimo e incubamos en medio Brackett sin suplemento de calcio fueron; tiempo cero de un 18.39 +- 9.48, a las 2 horas de incubación de 12.38 2 4.27; a las 4 horas de 14.89 2 6.51 y a las 6 horas de 16.43 5 8.17. 6 horas después, la muestra que se incubó 3 horas más en presencia del ionóforo, mostró el 28.12 2 4.59 de fluorescencia positiva y sin ionóforo el porciento de fluorescencia positiva fue de 17.7 2 8.2. Los resultados de las muestras obtenidas de cola de epidídimo e incubadas en presencia de medio Brackett con suplemento de Ca2+, fue en el tiempo cero 24.61 t 8.57, a las 2 horas de incubación 23.66 - +5.39, a las 4 horas 35.19 14.91; a las 6 horas 38.24 2 13.04. y en presencia de ionóforo, la fluorescencia positiva fue 70 2 7.5. Para los experimentos con muestras de espermatozoides eyaculados, fueron. Para las muestras incubadas en medio Brackett sin suplemento de Ca2’. Tiempo cero 16.6 2 7.5; 2 horas 23.06 2 11.4; 4 horas 29.6 f. 10.1 5; a las 6 horas 38.8 2 9.9; a las 9 horas 37 5 11.24 y la muestra con ionóforo fue de 40.02 2 13.85. Los espermatozoides de eyaculado incubados en medio Brackett con suplemento de calcio, para el tiempo cero, 23.1 2 4.49; para 2 horas de incubación 40.9 2 23.9; para 4 horas 41.1 2 17.8; para las 6 horas 42.6 2 19.2; para las 9 horas 60.2 2 8.47 y para la muestra con ionóforo de 75.9 2 7.8 Los resultados de este trabajo, evidencian que tanto espermatozoides de eyaculado como de cola de epidídimo, incubados en un medio capacitante, llevan a cabo movimientos de “flip-flop”, en sus membranas, con lo cual se produce la pérdida de la asimetría membranal, que es detectada en este caso por la presencia en la cara externa de fosfatidilserina. No se detectaron diferencias entre los espermatozoides de epidídimo y los de eyaculado. El incremento en la concentración de Ca2’ citosólico inducido por ionóforo A23187, o por incorporación de Caz’ al medio, produjo una distribución al azar de los lípidos de la membrana y, por ende, pérdida de la asimetría de los fosfolípidos de la membrana y la posterior formación de las vesículas, necesarias en la reacción acrosomal. En conclusión, podemos decir que hay importantes cambios en la distribución de fosfolípidos, en particular de fosfatidilserina que comienzan desde el proceso de capacitación y se van haciendo más evidentes conforme aumenta el tiempo de incubación. Es importante mencionar que la presencia de Caz’ en el medio favorece la respuesta en capacitación y aún más en la reacción acrosomal. El uso de la anexina VFlCT en la citometría de flujo es un método eficiente y sensible para evaluar los cambios que sufren las membranas del espermatozoide sometido a tratamiento de capacitación y reacción acrosomal.