Evaluación de la presencia de las caspasas 3 y 7 activas en los espermatozoides de rata, detección in situ vs ex situ - Quezada Vidal, Jesús (Universidad Autónoma Metropolitana, 2014)
Active caspases 3- and -7 are considered key in somatic and testicular germ cell apoptosis signalization. Strategies of in situ or ex situ label permits to identify cell expressing active caspases. The goal of the present work was to investigate whether exists differences between percentages of sperm labeled with distinct strategies and treated with inducers or inhibitors of active caspases. Sperm samples were obtained from seven males (CII-ZV), 90 days old, sexually mature and probed fertility. Sperm with active caspases -3 and -7 were treated with the inducer imiquimod (IMQ) or inhibitor zDEVD, or both, and labeled in situ (FLICA) or ex situ (NucView), or FLICA+NucView, and evaluated by flow cytometry. No differences were observed among percentages of sperm labeled with FLICA, NuCView, IMQ+FLICA e IMQ+NucView; however differences among treatments IMQ, zDEVD or IMQ+zDEVD labeled with FLICA+NucVIew. Sperm labeled with FLICA or NucView were identified by fluorescence microscopy, but when FLICA+NucView labeling was realized sperm FLICA negatives and NucView positives were observed. There were not differences between percentages of sperm positives to FLICA or NucView; although percentages of sperm expressing active caspases -3 and -7 were observed when labeling FLICA + NucView was realized.; Las caspasas 3 y 7 activas son consideradas clave en la señalización de la apoptosis en las células somáticas y células germinales testiculares. Existen dos estrategias que permiten identificar a las células que expresan caspasas activas, el marcaje in situ y el marcaje ex situ. El objetivo del presente trabajo fue investigar si existen diferencias en los porcentajes de espermatozoides marcados con las diferentes estrategias bajo distintos esquemas de inducción o de inhibición de caspasas activas. Las muestras espermáticas se obtuvieron de siete ratas macho (CII-ZV) de 90 días de edad, sexualmente maduros y con fertilidad comprobada. Los espermatozoides con caspasas 3 y 7 activas fueron tratados con el inductor imiquimod (IMQ) o el inhibidor zDEVD o ambos y marcados in situ (FLICA) o ex situ (NucView) o FLICA+NucView, y evaluados por citometría de flujo. Los porcentajes de espermatozoides marcados con FLICA, NucView, IMQ+FLICA e IMQ+NucView no presentaron diferencias significativas; pero hubo diferencias entre los tratamientos IMQ, zDEVD o IMQ+zDEVD y marcados con FLICA+NucVIew. Mediante microscopía de fluorescencia se identificaron espermatozoides marcados con FLICA, y espermatozoides marcados con NucView; pero en un marcaje FLICA+NucView algunos espermatozoides que fueron negativos a FLICA fueron positivos al reactivo de NucView. No se observaron diferencias en los porcentajes de los espermatozoides que expresan caspasas activas cuando se utilizó FLICA o NucView; sin embargo, se presentaron diferencias entre los porcentajes de los espermatozoides que expresan las caspasas 3 y 7 activas cuando los espermatozoides se incubaron con FLICA + NucView.