The situation of the populations of several mammal species worldwide is complex because, given the anthropogenic conditions, they are in a vulnerable state or even at risk. Big cats are in this situation despite international efforts to help. One part of these efforts of the International Union for Conservation of Nature (IUCN) is the use of reproductive biotechnologies. The cloning of embryos can be an important resource, as well as the use of animal models phylogenetically close to the species of interest, in this case, the domestic cat. Embryo cloning uses somatic cells of the species that needs to be cloned and enucleated mature oocytes (MII) of related species, as recipients of nuclei. In the present study, the granulosa cells derived from domestic cat oocytes were evaluated vs. skin fibroblasts, to establish cell cultures for a gene bank. Fibroblasts reached the fifth passage, while granulosa cells only reached the second passage. Fibroblasts cryopreserved at -196°C, had a satisfactory survival after thawing, but granulosa cells did not. In another experiment, domestic cat oocytes were matured in vitro, evaluating the effect of different hormonal treatments for in vitro maturation (IVM), being eCG 5UI, hCG 5UI and estradiol 1µg/mL supplemented in TCM-199 the best treatment. Furthermore, adding 10 µL of Insulin-transferrin-selenium (ITS) to the IVM medium, resulted in a higher rate (59% vs. 45% control group, P=0.001). The enucleation of MII oocytes had an efficiency of 98%. It is concluded that, although it was possible to derive granulosa cells from domestic cat, they did not survive beyond 2 cellular passages, nor freezing, making not possible to create a gene bank of these cells as nuclei donors for embryo cloning programs. On the other hand, the efficiency in the enucleation of MII oocytes demonstrates that they can be used as recipients of nuclei for embryo cloning in this species. Key words: Granulosa cells, fibroblasts, enucleation, cat.
La situación de las poblaciones de diversas especies de mamíferos a nivel mundial es compleja porque, dadas las condiciones antropogénicas, se encuentran en estado vulnerable o incluso en riesgo. Los grandes felinos se encuentran en esta situación a pesar de los esfuerzos internacionales para evitarlo. Una parte de estos esfuerzos de la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN) es el uso de biotecnologías reproductivas. La clonación de embriones puede ser un recurso importante, así como el uso de modelos animales filogenéticamente cercanos a la especie de interés, en este caso, el gato doméstico. La clonación de embriones utiliza células somáticas de la especie que se desea clonar y ovocitos maduros (Metafase II) enucleados de especies relacionadas, como receptores de núcleos. En el presente estudio, se evaluaron las células de la granulosa derivadas de ovocitos de gata doméstica vs. Fibroblastos de piel de la misma especie, para establecer cultivos celulares. Los fibroblastos alcanzaron el quinto pasaje, mientras que las células de la granulosa sólo alcanzaron el segundo pasaje. Los fibroblastos criopreservados a -196 °C tuvieron una supervivencia satisfactoria hasta del 90% después de la descongelación, pero las células de granulosa no sobrevivieron más allá del 2do pasaje. En otro experimento, se maduraron in vitro ovocitos de gata doméstica, evaluándose el efecto de diferentes tratamientos hormonales para la maduración in vitro (MIV), siendo el mejor tratamiento: eCG 5 UI, hCG 5 UI y estradiol 1 μg/mL suplementados en el medio TCM-199. Además, al agregar 10 µL/mL de insulina-transferrina-selenio (ITS) al medio de MIV, dio como resultado una tasa más alta (59 % vs. 45 % del grupo control, p = ≤ 0.001). La enucleación de ovocitos en Metafase (MII) tuvo una eficiencia del 98%. Se concluye que, si bien fue posible derivar células de la granulosa de gata doméstica, éstas no sobrevivieron más allá del 2do pasaje celular, ni a la congelación, por lo que se creó un banco de germoplasma de estas células en 2do pasaje como donadoras de núcleos para programas de clonación de embriones, mientras los fibroblastos llegaron hasta el 5to pasaje. Por otro lado, la utilización del ITS mejoró la MIV entretanto la eficiencia en la enucleación manual de ovocitos en MII demuestra que pueden ser utilizados como receptores de núcleos para la clonación de embriones en esta especie. Palabras clave: Células de la granulosa, fibroblastos, enucleación, gato.
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