Cucurbita ficifolia Bouché aumenta la secreción de insulina en la línea celular RINm5F a través de la afluencia de calcio proveniente de retículo endoplásmico Público Deposited

Introducción Cucurbita ficifolia Bouché (C. ficifolia) es una planta Mexicana de uso tradicional para el control de la diabetes tipo 2 (DT2). El efecto hipoglucémico del fruto de C. ficifolia ha sido demostrado en diferentes modelos de DT2 experimentales, así como en pacientes con DT2. El D-quiro-inositol (DQI) ha sido propuesto como el compuesto active del fruto. Además ha sido reportado que C. ficifolia incrementa la expression del RNAm de insulina y Kir 6.2 (componente del canal de K+ dependiente de ATP (K+ATP), cuando es activado por una sulfonilurea) en células RINm5F. Sin embargo, aún no queda claro si C. ficifolia y DQI causan secreción de insulina por incremento en las concentraciones de calcio intracelular [Ca2+]i, a través del bloqueo de los K+ATP, del reservorio proveniente del retículo endoplásmico (RE) o de la actividad del receptor de incretinas. Aunado a esto, se investigó si el factor de transcripción ATF-2 está involucrado en el aumento en la expresión del RNAm de insulina. Material y métodos El extracto acuoso de C. ficifolia fue obtenido y estandarizado de acuerdo a su contenido en DQI. Las células RINm5F fueron incubadas a diferentes concentraciones (50, 100, 200 and 400 μM) de DQI o C. ficifolia (9, 18, 36 and 72 µg of extracto/mL), y se cuantificaron los cambios en las [Ca2+]i. Las células fueron permeabilizadas con el fluorocromo (fluo 4 acetoximetil ester (Fluo 4-AM) y visualizados en el microscopio confocal. La secreción de insulina fue medida por el método de ELISA. Subsecuentemente, el efecto de C. ficifolia sobre los canales de K+ATP fue evaluado. En este caso, se utilizó un activador de los canales de K+ATP, como lo es diazóxido, para bloquear la afluencia de calcio inducida por C. ficifolia. Adicionalmente, 2-amino-toxidifenil borato (2-APB) fue utilizado para inhibir la afluencia de calcio proveniente de RE, causada por C. ficifolia. También fue evaluado el efecto C ficifolia, utilizando exendina-9 como inhibidor de la afluencia de calcio, proveniente de la actividad del receptor de incretinas. La fosforilación de ATF-2 fue medida por western blot. Resultados Se encontró que DQI solo no aumenta las [Ca2+]i ni la secreción de insulina. Por el contrario, el tratamiento con C ficifolia incrementa las [Ca2+]i en 10 veces comparado con el grupo control. La secreción de insulina incrementó un 46.9 %. Además, C. ficifolia incrementa 2.5 la fosforilación de ATF-2 a los 60 minutos, lo que probablemente esté relacionado con el aumento en la expresión del RNAm de insulina. En presencia de diazóxido, C. ficifolia disminuye las [Ca2+]i en un 50 %, y la secreción de insulina es aumentada en solo un 36.4%. Por otro lado, en presencia de 2-APB, C. ficifolia incrementa las [Ca2+]i 18 veces, indicando un efecto aditivo, la secreción de insulina se mantiene constante. Estos resultados indican que C. ficifolia no bloquea los canales de K+ATP, sin embargo, se observó efecto en las [Ca2+]i provenientes de RE. En presencia de exendina-9, C. ficifolia incrementa 2 veces la [Ca2+]i, observándose baja actividad del receptor de incretinas en comparación con la actividad del receptor de RE. Conclusiones Las propiedades hipoglucemiantes de C. ficifolia pueden ser explicadas, en parte por el efecto secretagogo de insulina a través del incremento en las [Ca2+]i provenientes de los reservorios del RE. Sugerimos que el mecanismo de acción de C. ficifolia es diferente al de los medicamentos hasta ahora utilizados para el tratamiento de la DT2, como las sulfonilureas. Estos resultados indican que C. ficifolia puede ser un potente agente natural para el control de la DT2.

Introduction Cucurbita ficifolia Bouché (C. ficifolia) is a plant used in Mexican traditional medicine to type 2 diabetes (T2D) control. The hypoglycemic effect of the fruit of C. ficifolia has been demonstrated in different experimental models and in T2D patients. It has been proposed that D-chiro-inositol (DCI) is the active compound of the fruit. Additionally, it has been reported that C. ficifolia increases the mRNA expression of insulin and Kir 6.2 (a component of the ATP-sensitive potassium (K+ATP) channel, which is activated by sulphonylurea) in RINm5F cells. However, it remains unclear whether C. ficifolia and DCI causes the secretion of insulin by increasing the concentration of intracellular calcium ([Ca2+]i) through K+ATP channel blockage, from the reservoir in the endoplasmic reticulum (ER) or from receptor activity incretin. Besides knowing if the transcription factor ATF-2 is involved in the increase in insulin mRNA expression by the extract. Material and methods: The aqueous extract of C. ficifolia was obtained and standardized with regard to its DCI content. RINm5F pancreatic β-cells were incubated with different concentrations (50, 100, 200 and 400 μM) of DCI alone or C. ficifolia (9, 18, 36 and 72 µg of extract/mL), and the [Ca2+]i was quantified. The cells were preloaded with the Ca2+ fluorescent dye fluo4-acetoxymethyl ester (AM) and visualized by confocal microscopy. Insulin secretion was measured by ELISA method. Subsequently, the effect of C. ficifolia on the K+ATP channel was evaluated. In this case, the blocker activator diazoxide was used to inhibit the C. ficifolia-induced calcium influx. In addition, the inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3)-receptor-selective inhibitor 2-amino-thoxydiphenylborate (2-APB) was used to inhibit the influx of calcium from the ER that was induced by C. ficifolia. To evaluate the C. ficifolia effect on the receptor activity incretin, exendin 9-39 was used to inhibit the influx of calcium from these receptors. Moreover, the activating transcription factor ATF2 was measured by western blot. Results: It was found that DCI alone did not increase [Ca2+]i or insulin secretion. In contrast, treatment with C. ficifolia increased [Ca2+]i 10-fold compared with the control group. Insulin secretion increased by 46.9%. In the presence of diazoxide, C. ficifolia decreased [Ca2+]i by 50%, while insulin secretion increased by 36.4%. In contrast, in the presence of 2-APB, C. ficifolia increased [Ca2+]i 18-fold, while insulin secretion remained constant, indicating an additive effect. Therefore, C. ficifolia was not found to block the K+ATP channel. However, it did exert an effect by increasing [Ca2+]i from the ER, which may partly explain the insulin secretion observed following treatment with C. ficifolia. In presence of Exendin-9, C. ficifolia increased 2-fold [Ca2+]i, without affecting incretin receptors. Furthermore, C. ficifolia increased 2.5 times the activity of the transcription factor ATF-2 at 60 min. Conclusions: The hypoglycemic properties of C. ficifolia can be explained in part by its effect as insulin secretagogue through an increase in [Ca2+]i from ER calcium reservoir. Therefore, the mechanism of action of C. ficifolia is different to those of the currently used hypoglycemic drugs, such as sulfonylureas. These results support that C. ficifolia may be a potential natural resource for new agents to T2D control.

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